甲潑尼龍琥珀酸鈉對自身免疫性肺氣腫模型大鼠氧化應激和抗內皮細胞抗體的影響

李佳藝 張程 李本雪 張野 張湘燕

中圖分類號 R965 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）10-1208-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.10

摘 要 目的：研究甲潑尼龍琥珀酸鈉對自身免疫性肺氣腫模型大鼠氧化應激和抗內皮細胞抗體（AECA）的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組，每組8只。除對照組大鼠腹腔注射等體積的完全弗氏佐劑外，模型組和干預組大鼠均腹腔注射體外培養的人臍靜脈內皮細胞+完全弗氏佐劑混合物以復制自身免疫性肺氣腫模型;造模給藥后第2天，干預組大鼠腹腔注射甲潑尼龍琥珀酸鈉10 mg/（kg·d），對照組和模型組大鼠均腹腔注射等體積的生理鹽水，每日1次，連續21 d。末次給藥后，取各組大鼠右肺組織制作石蠟切片并行蘇木精-伊紅染色，觀察肺組織病理變化，測量單位面積內的肺泡數（MAN）和內襯間隔（MLI）;檢測左肺肺泡灌洗液（BALF）中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，以及BALF和血清中AECA含量。采用Pearson分析模型組大鼠BALF中AECA與MDA、GSH、SOD、GSH-Px的相關性。結果：與對照組比較，模型組大鼠肺組織可見明顯的肺氣腫病理變化，其MAN顯著減少，MLI顯著延長（P<0.01）;BALF中GSH含量和SOD、GSH-Px活性均顯著降低，BALF中MDA含量以及BALF、血清中AECA含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，干預組大鼠肺組織的肺氣腫病理變化明顯改善，其MAN顯著增加，MLI顯著縮短（P<0.01）;BALF中GSH含量和SOD、GSH-Px活性均顯著升高;BALF中MDA含量以及BALF、血清中AECA含量均顯著降低（P<0.01）。模型組大鼠BALF中的AECA與MDA呈正相關（r=0.710，P<0.05），與GSH、SOD、GSH-Px呈負相關（r=-0.754、-0.781、-0.736，P<0.05）。結論：甲潑尼龍琥珀酸鈉可能通過減輕氧化應激反應、抑制AECA的表達，從而達到預防自身免疫性肺氣腫的目的。

關鍵詞 自身免疫性肺氣腫;氧化應激;抗內皮細胞抗體;甲潑尼龍琥珀酸鈉;大鼠

Effects of Methylprednisolone Sodium Succinate on Oxidative Stress and AECA of Autoimmune Emphysema Model Rats

LI Jiayi，ZHANG Cheng，LI Benxue，ZHANG Ye，ZHANG Xiangyan（Dept. of Respiratory and Critical Medicine， Guizhou Provincial Peoples Hospital/NHC Key Laboratory of Pulmonary Immunological Diseases， Guiyang 550002， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of methylprednisolone sodium succinate on oxidative stress and anti-endothelial cell antibody （AECA） of autoimmune emphysema model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into control group， model group and intervention group， with 8 rats in each group. Except that control group was given same volume of complete Freunds adjuvant intraperitoneally， model group and intervention group were given the mixture of human umbilical vein endothelial cells and complete Freunds adjuvant intraperitoneally to establish the model of autoimmune emphysema. On 2nd day after modeling， intervention group was intraperitoneally injected with 10 mg/（kg·d） methylprednisolone sodium succinate. Control group and model group were intraperitoneally injected the same volume of normal saline， once a day， for consecutive 21 days. After last medication， the right lung tissue of rats were taken for paraffin section and HE staining in each group， and the pathological changes of lung tissue were observed. The mean alveolar number （MAN） and mean linear intercept （MLI） were measured. The contents of MDA and GSH， the activities of SOD and glutathione peroxidase （GSH-Px） in bronchial alveolar lavage fluid （BALF） of left lung were determined; the contents of AECA in BALF and serum were also determined. The correlation of AECA with MDA， GSH， SOD and GSH-Px were determined in model group by Pearson analysis. RESULTS： Compared with control group， the pathological changes of pulmonary emphysema were obvious in model group， MAN decreased significantly， and MLI prolonged significantly （P<0.01）; GSH content， GSH-Px and SOD activities in BALF were decreased significantly， the contents of AECA in BALF and serum were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the pathological changes of pulmonary emphysema was improved significantly in the intervention group， MAN increased significantly， while MLI shortened significantly （P<0.01）; GSH content， SOD and GSH-Px activities were increased significantly， while the contents of AECA in BALF and serum were decreased significantly （P<0.01）. AECA in BALF of rats in model group was positively correlated with MDA （r=0.710， P<0.05）， and the AECA were negatively correlated with GSH， SOD and GSH-Px （r=-0.754， -0.781， -0.736，P<0.05）. CONCLUSIONS： Methylprednisolone sodium succinate may achieve the purpose of the prevention of autoimmune emphysema through reducing oxidative stress and inhibiting the expression of AECA.

KEYWORDS? ?Autoimmune emphysema; Oxidative stress; Anti-endothelial cell antibodies; Methylprednisolone sodium succinate; Rat

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是常見的呼吸道疾病，常因接觸有毒的顆粒或氣體導致患者氣道和肺泡異常，以持續的呼吸道癥狀和氣流限制為特征[1]。肺氣腫是指終末細支氣管遠端的氣道彈性減退，過度膨脹、充氣和肺容積增大或伴有氣道壁破壞的病理狀態。COPD主要包括慢支炎和肺氣腫兩種病理變化。國內外研究證實，自身免疫反應、氧化應激、抗內皮細胞抗體（AECA）均參與了肺氣腫或COPD的發生[2-5];另外，本課題組前期研究也發現，氧化應激與自身免疫性肺氣腫的形成關系密切[6]。那么，AECA是否可通過增強氧化應激的途徑而促進自身免疫性肺氣腫的形成？臨床上常用的抗免疫藥物糖皮質激素對其干預效果如何？目前國內外尚無文獻報道。因此，本研究擬以自身免疫性肺氣腫模型大鼠為研究對象，在造模給藥后（沒有形成肺氣腫前）第2天立即給予甲潑尼龍琥珀酸鈉進行干預，檢測其肺泡灌洗液（BALF）中丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性，以及BALF和血清中AECA的含量，以驗證氧化應激指標與AECA的關系并評估甲潑尼龍琥珀酸鈉的預防效果，旨為肺氣腫和COPD的治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司）;ST16R型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司）;HH.W21.420型電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療器械有限公司）;HF160W型CO2恒溫培養箱（新加坡Esco公司）;T6新世紀型分光光度儀（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（比利時Pfizer公司，批號：AJ5591，規格：40 mL）;完全弗氏佐劑（美國Sigma-Aldrich公司，批號：20190102，規格：10 mL）;GSH檢測試劑盒（美國Cayman公司）;GSH-Px測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）;SOD、MDA檢測試劑盒（美國AAT Bioquest公司）;AECA酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Abbkine公司）;M199培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液（美國 Gibco公司）;青霉素-鏈霉素溶液（美國Hyclone公司）;血管內皮生長因子（VEGF，英國Peprotech公司）;蘇木精-伊紅（HE）染色液（珠海貝索生物技術有限公司）;氯化鈉注射液（貴州科倫藥業有限公司，規格500 mL ∶ 4.5 g，作生理鹽水用）;其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠24只，雄性，10周齡，體質量240～280 g，由重慶市騰鑫科技公司提供，動物生產許可證號為SCXK（渝）2017-0010。實驗室按正常晝夜節律，室內溫度約為22 ℃;所有大鼠均以深圳市騰鑫科技公司提供的無菌全營養飼料喂養，飲水為飲用水。

1.4 人臍帶

人臍帶樣品取自貴州中醫藥大學第一附屬醫院產科孕婦足月自然分娩后的臍帶，且上報醫院醫學倫理委員會批準、備案，并經產婦及其家屬簽字同意。

2 方法

2.1 細胞培養

取人臍帶樣品，參照本課題組前期晏木云[7]報道的提取人臍帶靜脈內皮細胞方法并加以改進完善后，提取靜脈內皮細胞，并進行培養、傳代及鑒定。

2.2 造模

參照國外相關研究及本課題組前期經驗[5，8]復制模型，基本步驟如下：取第5代人臍帶靜脈內皮細胞1×107個，加入胰蛋白酶，于37 ℃消化約45 s，以1 000 r/min離心15 min，取沉淀加入新鮮M199培養基（其中青霉素-鏈霉素占0.97%，胎牛血清占19.4%，VEGF占1.94%）1 mL后，再加入完全弗氏佐劑1 mL，混勻。將上述混合物注入大鼠腹腔以建立自身免疫性肺氣腫模型。

2.3 分組與給藥

將SD大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組，每組8只。除對照組大鼠單次腹腔注射等體積的完全弗氏佐劑外，模型組和干預組大鼠均按“2.2”項下方法單次腹腔注射體外培養的人臍帶靜脈內皮細胞+完全弗氏佐劑混合物復制自身免疫性肺氣腫模型。造模給藥后第2天，干預組大鼠腹腔注射甲潑尼龍琥珀酸鈉10 mg/（kg·d）（劑量參照李莉等[9]的報道及本課題組前期研究[10]設計），對照組和模型組大鼠均腹腔注射等體積氯化鈉注射液，每日1次，連續21 d。

2.4 樣品采集

末次給藥后，稱量各組大鼠體質量，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，以仰臥位固定四肢，常規碘伏消毒皮膚后打開腹腔，游離腹主動脈，取腹主動脈血15 mL左右，分裝于3～5個血清管中，于22 ℃下靜置30 min后，以2 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存;另參照文獻報道的方法[11]，用手術線結扎各組大鼠右主支氣管;抽取生理鹽水1 mL注入左肺后回收BALF，反復4次，共收集BALF約4 mL，以1 500? r/min離心10 min后取上清液，置于-80 ℃冰箱凍存。

2.5 指標檢測

參照本課題組前期經驗[11]，取各組大鼠右肺制作石蠟切片，經HE染色后，使用光學顯微鏡觀察肺組織的病理變化。隨機選取每張HE染色切片3個視野，測量長、寬，計算視野面積，并計數總肺泡數，以總肺泡數/視野面積計算單位面積內的肺泡數（MAN）。然后取視野長和寬中點，畫一個十字交叉線，算出十字線總長度，并計數該線上的肺泡隔數，以總長度/肺泡隔數計算內襯間隔（MLI）。使用分光光度儀按相應檢測試劑盒說明書方法檢測各組大鼠BALF中MDA、GSH含量和SOD、GSH-Px活性，以及BALF和血清中AECA含量。

2.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。所有數據經K-S檢驗，符合正態分布且方差齊時，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗;不符合正態分布時，計量資料以四分位數間距表示，采用非參數檢驗。相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 肺組織病理變化

對照組大鼠肺泡間隔完整，肺組織結構正常，詳見圖1A;模型組大鼠肺組織可見部分區域肺泡擴張，部分肺泡間隔變窄，肺泡間隔斷裂所致的相鄰肺泡融合成一個大的囊腔，呈現出明顯的肺氣腫病理現象，詳見圖1B;干預組大鼠肺組織可見肺氣腫病理改變，但改變程度不及模型組嚴重，詳見圖1C。

與對照組比較，模型組大鼠的MAN顯著減少，MLI顯著延長（P<0.01）;與模型組比較，干預組大鼠的MAN顯著增加，MLI顯著縮短（P<0.01），詳見表1。

注：與對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

Note： vs. control group，*P<0.01; vs. model group，#P<0.01

3.2 氧化應激相關指標變化

與對照組比較，模型組大鼠BALF中MDA含量顯著升高，GSH含量和SOD、GSH-Px活性均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，干預組大鼠BALF中MDA含量顯著降低，GSH含量和SOD、GSH-Px活性均顯著升高（P<0.01），詳見表2。

注：與對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

Note： vs. control group，*P<0.01; vs. model group，#P<0.01

3.3 AECA含量變化

與對照組比較，模型組大鼠BALF和血清中AECA含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，干預組大鼠BALF和血清中AECA含量均顯著降低（P<0.01），詳見表3。

注：與對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

Note： vs. control group，*P<0.01; vs. model group，#P<0.01

3.4 AECA與氧化應激指標相關性

通過對模型組大鼠BALF中AECA與氧化應激指標進行相關性分析發現，AECA與MDA呈正相關（r=0.710，P<0.05）;AECA與GSH、SOD、GSH-Px呈負相關（r=-0.754、-0.781、-0.736，P<0.05），詳見圖2。

4 討論

眾所周知，慢性氣道炎癥、氧化應激反應、蛋白酶-抗蛋白酶失衡三大機制在COPD發生發展過程中占有至關重要的地位[12-15]。越來越多的證據表明，細胞和抗體介導的自身免疫在COPD的發生發展過程中發揮著重要作用[3]。Caramori G等[16]證實氧化應激產生的蛋白可能通過自身免疫反應引起特征性小氣道異常，參與COPD的發生，因而COPD可被認為是一種自身免疫性疾病。

國外學者及本課題組前期研究均提取人臍靜脈內皮細胞并建立自身免疫性肺氣腫大鼠模型，實踐證實，將異種血管內皮細胞接種至免疫功能正常的大鼠體內可誘導血清中AECA含量升高，最終導致自身免疫性肺氣腫的發生[5，7，11]。本研究通過復制模型制作病理標本，于顯微鏡下可觀察到模型組大鼠肺組織呈現明顯的肺氣腫改變，且與對照組比較，模型組大鼠的MAN顯著減少、MLI顯著延長;BALF及血清中AECA含量也顯著升高，和文獻報道[5]一致，提示自身免疫性肺氣腫模型已成功建立。

糖皮質激素能夠通過與糖皮質激素受體結合，抑制炎癥基因的表達、影響花生四烯酸的代謝、促進炎癥細胞凋亡、抑制炎癥介質的合成[17-18]，對慢性氣道炎癥具有良好的抗炎作用，故被廣泛用于COPD急性加重患者的臨床治療。此外，該藥亦可通過與細胞質中的糖皮質激素受體結合，對免疫細胞的多種功能及免疫反應的多個環節發揮抑制作用（主要抑制細胞免疫）;且作為一種免疫抑制劑，該藥亦被用于皮肌炎、系統性紅斑狼瘡、抗中性粒細胞胞漿抗體（ANCA）相關性血管炎等自身免疫性疾病的治療[19]。本研究結果顯示，干預組大鼠肺組織切片亦可見肺氣腫改變，但不及模型組嚴重，提示甲潑尼龍琥珀酸鈉可以預防病理學意義上的肺氣腫。此外，通過測定血清和BALF中AECA含量以及BALF中氧化應激相關指標可知，與模型組比較，干預組大鼠BALF中GSH含量和SOD、GSH-Px活性均顯著升高;BALF中MDA含量以及BALF、血清中AECA含量均顯著降低。

國內外有許多文獻均提示，氧化應激參與了吸煙肺氣腫的發生[14，20];本課題組前期研究也證實，氧化應激對自身免疫性肺氣腫的形成有重要作用[6]。張琳瓊等[21]研究指出，氧化/抗氧化失衡可導致細胞代謝紊亂，亦可損傷血管內皮細胞;胡晶等[22]發現，過敏性紫癜患兒血清中AECA與MDA呈正相關，與抗氧化指標對氧磷酶、過氧化氫酶呈負相關，提示AECA可通過加重氧化/抗氧化失衡而導致過敏性紫癜的發生。本研究通過對自身免疫性肺氣腫模型大鼠BALF中AECA與氧化應激指標相關性分析發現，AECA與MDA呈正相關，與GSH、SOD、GSH-Px呈負相關，提示上述指標間存在顯著相關性，進而說明AECA可能通過增強氧化應激引起大鼠自身免疫性肺氣腫的發生。

綜上所述，甲潑尼龍琥珀酸鈉可能通過減輕氧化應激反應、抑制AECA的表達，從而達到預防自身免疫性肺氣腫的目的。本研究的不足之處在于僅以大鼠為研究對象，后期本課題組將進行臨床相關研究。

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（收稿日期：2019-12-10 修回日期：2020-02-26）

（編輯：鄒麗娟）