氧化石墨烯對紫花苜蓿幼苗生理生態特征的影響

朱先貴，趙樹蘭，多立安

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

碳納米材料是指在三維空間尺度中至少有一維處于納米量級（1～100 nm）的材料，目前碳納米材料主要有石墨烯（graphene）、碳納米管（carbon nanotubes）、富勒烯（fullerene）等.其中，石墨烯是由碳原子以sp2雜化軌道組成的平面二維晶體.氧化石墨烯（GO）是石墨烯的氧化物，一般由石墨經強酸氧化而得，作為一種性能優越的新型碳材料，在光電、熱導涂料、太陽能電池及環境污染修復等諸多領域應用廣泛[1].同時，GO的大量使用對環境造成的風險也隨之增加，其環境效應逐漸引起研究者的關注[2-3].目前，關于GO 環境效應的研究涉及動植物以及微生物等各個方面.如Jia 等[4]的研究表明，GO 會影響斑馬魚腸道微生物的多樣性，增加斑馬魚中的病原細菌群落，誘導對腸道組織的損害并激活炎癥反應.Zhao 等[5]的研究表明，石墨烯對藻類會構成環境脅迫，藻類通過減少膜損傷和直接接觸的機會來減輕石墨烯材料造成的損傷.Wang 等[6]的研究表明，GO 可以增強殺蟲劑對昆蟲的作用效果.

目前關于GO 對植物影響的研究多集中在禾本科. 如Shen 等[7]對水稻的研究發現，水培時加入GO（50 mg/L）會使水稻根長變短；殷玲玉[8]用水培法培育玉米時發現，培養液中加入GO（500 mg/L）使玉米苗的鮮重與對照相比減少了47%；Chen 等[9]的研究發現，水培時高濃度的GO（≥0.4 mg/mL）抑制了小麥的萌發.這些研究通常采用水培實驗，土培盆栽很少見，而后者能夠更精準地模擬GO 輸入到土壤環境中對植物生長的影響.GO 進入土壤后對豆科植物及其固氮特性影響的研究鮮有報道，而豆科植物作為地球生物固氮的主體，生態價值極其重要[10-11].本研究以常見的豆科根瘤共生固氮植物紫花苜蓿（Medicago sativa）為模式植物，采用土培方式，觀察紫花苜蓿在生長和生理生態特征方面對GO 脅迫作出的響應，以期為深入探討GO 對豆科植物固氮作用機制的影響以及GO 應用對自然界生物固氮的風險評價提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

紫花苜蓿種子，購于北京正道種業有限公司.氧化石墨烯（GO），購自蘇州碳豐科技有限公司，為褐黃色粉末，質量分數大于95%，平均厚度3.4～8.0 nm，片層直徑10～50 μm，層數5～10 層，比表面積100～300 m2/g.土培基質取自天津師范大學校園內生物學試驗區10～20 cm 深度的土壤，含鹽質量分數0.1%，有機質4.68%，全氮0.22%，全鉀45.61%，有效磷22.03 mg/kg，飽和含水量0.56 mL/kg，土壤容重0.87 g/cm，pH 值為7.45.

種子播種于塑料花盆（上下直徑分別為23 cm 和17 cm，高18 cm）內，每盆裝入2500 g 土壤，土壤中加入不同質量的GO，混勻.根據土壤中GO 的質量分數，共設置4個處理組：CK（不添加GO）、0.2%、0.4%和0.6%，每個處理4 次重復.每盆播種2 g，于室內采光良好處進行栽培，光照強度600～28000 Lx. 定期適量澆水，使土壤含水量保持在最大持水量的60%，培養期間環境平均溫度約為25 ℃，空氣相對濕度為17%～54%.種子萌發50 d 后測定相關指標.

1.2 指標測定方法

株高和生物量的測定：選取長勢均勻且良好的植株用直尺測量絕對株高，5 次測量取平均值.將收獲的植物地上部莖和葉分開，用蒸餾水洗凈并用濾紙吸取水分后，在108 ℃下殺青20 min，再于80 ℃下烘干至恒重后稱量.

葉片質膜透性的測定：取葉片剪碎，用10 mL 去離子水作為浸提液浸泡12 h，使用電導儀測定電導率R1，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，測得浸提液電導率R2，計算電解質相對外滲率[12].

葉綠素和類胡蘿卜素含量的測定：取葉片剪碎，避光，浸泡于無水乙醇與丙酮等體積混合液中，使用分光光度計（UV-1700，日本島津公司）于663、645 和470 nm 處測量OD 值[13].

MDA 含量和抗氧化酶活性的測定[14]：MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸氧化法，POD 活性測定采用愈創木酚法，CAT 活性測定采用分光光度法，SOD 活性測定采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光化還原法.

1.3 數據處理

采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Tukey 法在P = 0.05 水平進行數據差異的統計學意義檢驗，采用Origin 軟件繪圖.

2 結果與分析

2.1 GO 添加對紫花苜蓿株高和地上生物量的影響

土壤中添加不同質量的GO 后，紫花苜蓿的生長情況如圖1 所示.由圖1 可以看出，隨著GO 質量分數的增加，紫花苜蓿莖、葉生物量和株高均呈現先增加后降低的趨勢.0.2%GO 處理下，紫花苜蓿的莖、葉生物量較對照組顯著增加（P ＜0.05），株高較對照組輕微增加，差異不顯著（P ＞0.05）.0.4%和0.6%GO 處理組中，紫花苜蓿的莖、葉生物量和株高均顯著降低，且GO 添加量越大，紫花苜蓿生長越差，GO 質量分數為0.6%時，與對照組相比，莖、葉生物量分別降低了52.72%和81.96%，株高降低了26.09%.

2.2 GO 添加對紫花苜蓿葉片質膜透性的影響

土壤中添加不同質量的GO 后，紫花苜蓿的葉片質膜透性如圖2 所示.由圖2 可以看出，隨著GO 質量分數的增加，質膜透性呈現先減后增的趨勢.與對照組相比，0.2%GO 處理組中紫花苜蓿葉片的質膜透性降低了21.30%（P ＜0.05）. 與對照組相比，0.4%GO 處理組中葉片的質膜透性略有增加（P ＞0.05），0.6%GO處理組增加了41.11%，差異具有統計學意義（P ＜0.05）.

圖1 不同GO 處理組中紫花苜蓿的株高和生物量Fig.1 Plant height and biomass of Medicago sativa in different GO treatment groups

圖2 不同GO 處理組中紫花苜蓿的葉片質膜透性Fig.2 Plasma membrane permeability of Medicago sativa leaves in different GO treatment groups

2.3 GO 添加對紫花苜蓿葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

不同GO 處理組中，紫花苜蓿的葉綠素和類胡蘿卜素含量如表1 所示.由表1 可以看出，葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量均隨著GO 質量分數的增加而減少.與對照組相比，0.2%處理組中的葉綠素a 含量略有下降（P ＞0.05），葉綠素b 和總葉綠素含量顯著下降；0.4%和0.6%GO 處理組中，三者均顯著降低.類胡蘿卜素含量隨著GO 濃度升高呈現先升后降的趨勢，與對照組相比，0.2%GO 處理組中類胡蘿卜素含量顯著提高了67.28%，0.4%和0.6%GO 處理組分別降低了21.60%和38.89%，差異具有統計學意義（P ＜0.05）.

表1 不同GO 處理組中紫花苜蓿葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量Tab.1 Chlorophyll and carotenoid contents of Medicago sativa leaves in different GO treatment groups（mg·g-1）

2.4 GO 添加對紫花苜蓿丙二醛含量和抗氧化酶活性的影響

不同GO 處理組中，紫花苜蓿的MDA 含量如圖3（a）所示，抗氧化酶活性如圖3（b）—圖3（d）所示.由圖3（a）可以看出，紫花苜蓿葉片和莖中的MDA 含量均隨著GO 質量分數的升高呈現先降后升的趨勢.0.2%GO 處理組中，葉和莖的MDA 含量與對照組相比均顯著下降；0.4%GO 處理組中，葉的MDA 含量與對照組相比略有增加（P ＞0.05），莖的MDA 含量較對照組增加了19.76%（P ＜0.05）；0.6%GO 處理組中，葉和莖的MDA 含量與對照組相比均顯著增加（P ＜0.05）.

由圖3（b）可以看出，葉和莖中的CAT 活性均隨著GO 質量分數的升高呈增加趨勢. 與對照組相比，3個GO 處理組中，葉中的CAT 活性均顯著增加，0.6%GO 處理組增加了110.53%；0.2%和0.4%GO 處理組中，莖中的CAT 活性較對照組略有增加，0.6%GO處理組與對照組相比增加了34.56%（P ＜0.05）.由圖3（c）和圖3（d）可以看出，紫花苜蓿莖、葉中的SOD 和POD 活性均隨著GO 質量分數的升高呈現先降后升的趨勢.0.2%GO 處理組中，葉和莖的SOD 和POD 活性與對照組相比均顯著下降（P ＜0.05）；0.4%GO 處理組中，葉片的SOD 和POD 活性與對照組的差異不顯著（P ＞0.05），莖的SOD 和POD 活性均顯著高于對照組（P ＜0.05）；0.6%GO 處理組中，葉片的SOD 活性顯著高于對照組（P ＜0.05），POD 活性與對照組相比差異不顯著（P ＞0.05），莖的SOD 和POD 活性均顯著高于對照組（P ＜0.05）.

圖3 不同GO 處理組中紫花苜蓿的MDA 含量和抗氧化酶活性Fig.3 MDA content and antioxidant enzyme activity of Medicago sativa in different GO treatment groups

3 討論與結論

環境中的GO 會在一定程度上影響植物的生長和生理特征.本研究利用添加不同質量GO 的土壤培養豆科植物紫花苜蓿，結果發現，隨著GO 質量分數的增加，紫花苜蓿的生物量和株高均呈現先升后降的趨勢，表明高濃度GO 對植株生長有顯著的抑制作用. 低濃度GO 處理下（0.2%）紫花苜蓿的生物量顯著增加，株高增加不顯著.Chen 等[15]的研究發現燕麥在低濃度（0.04 mg/mL）GO 處理下地上部分干重較對照組增加，而當GO 濃度繼續增加時燕麥干重顯著減少，這與本研究得到的結果一致.質膜透性是反映細胞膜透性的重要依據，通常逆境脅迫程度越高，質膜透性越大，表明細胞膜的選擇透過性越差[16].本研究發現，較高濃度GO 處理下（≥0.4%）紫花苜蓿葉片的質膜透性顯著提高，說明GO 的添加對紫花苜蓿構成了逆境脅迫，而低濃度GO（0.2%）處理下紫花苜蓿質膜透性反而降低.有研究表明，與葉相比，環境脅迫對紫花苜蓿根部結瘤部位造成的細胞膜破壞更嚴重，也更難恢復，從而阻礙了根瘤的生長[17].因此推測，GO 脅迫對紫花苜蓿根部的細胞膜會造成嚴重破壞.

葉綠素是完成光合作用必不可少的組分，與植物生長有著密切的聯系.本研究表明，GO 處理下紫花苜蓿葉綠素含量顯著降低，可能是GO 形成的環境脅迫抑制了葉綠素的合成.Jokinen 等[18]研究表明，豆科植物的固氮需要很多光合產物.當葉綠素含量下降時，光合作用必然受到影響，豆科植物的固氮效率也會下降.GO 對植物的影響因GO 濃度、植物與GO 的接觸時間、植物自身種類不同而有差異[19].王鑫禹等[20]的研究表明，高羊茅培養到50 d 時基質中添加1%的GO，與對照相比株高增加了4.03%，葉綠素a、b 含量無顯著變化.而紫花苜蓿在GO 添加超過0.4%時就表現出明顯的脅迫反應，株高和葉綠素含量均顯著下降.由此可知，與禾本科植物高羊茅相比，紫花苜蓿對GO 添加更敏感.

植物在逆境脅迫下，細胞產生的活性氧增加，抗氧化防御系統會提高CAT、POD、SOD 等酶的活性，其中，SOD 可以催化超氧自由基反應產生H2O2，POD 和CAT 可以催化H2O2反應，以此來消耗過量的活性氧，減輕活性氧帶來的脅迫[21].本研究結果表明，高濃度GO處理下，紫花苜蓿的CAT、POD、SOD 活性均有顯著提高，這是因為高濃度GO 對紫花苜蓿造成了脅迫，使紫花苜蓿的抗氧化防御系統提高相關酶的活性.而低濃度GO 對紫花苜蓿生長有一定促進作用，所以0.2%GO處理下POD、SOD 含量較對照組都有所降低.MDA 是反映膜脂過氧化程度的指標，其含量的增加會加劇膜損傷.本研究中，在高濃度GO 處理組中紫花苜蓿的MDA 含量較對照組顯著增加，說明此時紫花苜蓿受到脅迫，而低濃度GO 處理組中MDA 含量較對照組減少，是因為低濃度下GO 對紫花苜蓿生長具有一定促進作用，這與保護酶活性以及葉片質膜透性的變化趨勢一致.Chen 等[15]研究發現，GO 對水培和土培的裸燕麥均造成了氧化脅迫，CAT 和MDA 含量隨GO 濃度增加而提高.在紫花苜蓿的環境脅迫研究中，Salah 等[17]發現鹽脅迫對紫花苜蓿生長的影響與電解質泄漏有關，鹽脅迫使葉片電解質泄露增加6 倍，使結瘤部位電解質泄露增加5 倍，而且鹽脅迫會使根部結瘤處和葉片的SOD 酶活性增加.因此，本研究推測GO 可能是通過改變細胞質膜透性對紫花苜蓿產生脅迫作用.

綜上所述，GO 處理對紫花苜蓿的生長和生理生態特征有顯著影響，較低濃度的GO 處理就可能會使紫花苜蓿受到嚴重脅迫.GO 添加到土壤后，降低了紫花苜蓿的葉綠素含量，抑制了光合作用，不利于其生長，而且隨GO 質量分數的增加抑制作用增強，SOD、POD 和CAT 活性升高，MDA 含量也會增加.基于這些結果，本課題組將進一步探究GO 對苜蓿等豆科植物結瘤及固氮機制等方面的影響.