IL-27通過PI3K/Akt通路對哮喘小鼠氣道重塑的影響

李 鑫,劉圓圓,張才擎

(1.濰坊醫學院臨床醫學院內科學教研室，山東 濰坊 261053；2.山東大學附屬山東省千佛山醫院呼吸內科，山東 濟南 250014；3.山東第一醫科大學第二附屬醫院呼吸內科，山東 泰安 271000)

支氣管哮喘是由多種細胞參與的氣道炎癥性疾病，長期慢性炎癥導致氣道高反應性、氣道阻塞、粘液分泌過多和氣道重塑。但近年來，人們逐漸認識到僅靠氣道炎癥并不足以解釋哮喘的發病機制。氣道重塑包括細胞外基質蛋白沉積導致基底膜增厚、上皮下纖維化、杯狀細胞化生、粘液分泌過多，引起氣流受限進一步導致氣道高反應性，肺功能下降，從而損害肺的結構和功能[1]。

白介素27(interleukin-27，IL-27)是一種屬于IL-12家族的細胞因子，主要由抗原呈遞細胞產生，包括樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞等[2]。這種細胞因子與IL-27受體結合并傳遞信號。IL-27可以通過刺激單核細胞、成纖維細胞、肥大細胞、上皮細胞等誘發一系列炎癥事件[3]。另一方面，IL-27具有抗炎作用，能抑制Th1、Th2、Th17細胞亞群的發育，進一步促進IL-10的產生[4]。此外，研究表明，IL-27能夠抑制哮喘小鼠的氣道炎癥[5]。

PI3K/Akt信號通路是參與細胞生長、存活、增殖、凋亡、蛋白合成、逆轉錄和自噬的重要信號通路。羅紅霉素可能通過PI3K/Akt通路抑制氣道平滑肌細胞增殖[6]。Xu等[7]發現，黃芩通過PI3K/Akt/NF-κB通路減輕香煙煙霧介導的COPD大鼠氣道重塑。益肺散結方通過PI3K/Akt/mTOR信號通路增強小鼠肺纖維化模型的自噬作用進而抑制肺纖維化[8]。我們通過建立哮喘小鼠模型，進一步研究IL-27對哮喘小鼠氣道重塑的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物18只清潔級BALB/c ♀小鼠，8～10周齡，體質量(20±2)g，購于山東大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(魯)20190003。

1.2 主要試劑卵蛋白(ovalbumin，OVA)購于美國Sigma 公司,鼠IL-27因子(貨號：2799-ML-010)購于美國R&D 公司，抗α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(貨號：56856S)、p-Akt抗體(貨號：4060T)、Akt抗體(貨號：4691T)購于美國CST公司，抗GAPDH抗體(貨號：60004-1-Ig)購于美國protein Technology Group公司，TRIzol試劑購于Invitrogen公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和超敏ECL化學發光試劑盒購于中國碧云天生物技術研究所。超聲霧化器購于德國PARI BOY RX公司，Bio-Rad CFX96 Touch q-PCR系統購于美國Bio-Rad Laboratories公司，Olympus光學顯微鏡購于日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1哮喘小鼠模型[5]18只小鼠按照隨機的原則分為3組：對照組、哮喘組、IL-27治療組。IL-27治療組在d 0～d 14給予IL-27(50 ng/只，每天2次)滴鼻治療，哮喘組和IL-27組在d 7和d 14腹腔注射OVA混懸液(1 mg OVA+100 mg氫氧化鋁)致敏，空白組以等量PBS代替。在d 21～d 35，哮喘組和IL-27治療組給予1% OVA溶液(OVA 0.1 g+生理鹽水10 mL)霧化30 min，每天1次，IL-27治療組在霧化前30 min給予IL-27(50 ng/只)滴鼻，對照組用等量PBS霧化吸入。在最后一次激發后24 h內麻醉并處死各組小鼠。

1.3.2肺組織HE染色 取部分肺組織固定，脫水,石蠟包埋、切片， 厚度4 μm，HE 染色，封片，400倍光鏡下觀察，觀察每組小鼠炎癥細胞的浸潤情況、氣道壁的厚度及氣道損傷情況。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對氣道壁總面積(Wat)進行評估，采用基底膜周長(Pbm)對Wat進行統一化。采用Wat/Pbm比值(Wat/Pbm)評價氣道重構。

1.3.3肺組織Masson染色 部分肺組織切片脫蠟,蘇木精染色，中性樹膠固定。在光學顯微鏡下觀察，最后用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對測定上皮下 Masson 陽性面積(μm2)和支氣管基底膜周長(μm)，以支氣管基底膜周長進行標準化，分析膠原沉積情況。

1.3.4免疫組織化學法測定α-SMA表達量 固定好的肺組織切片，脫蠟、再水化，抗原修復。在37℃下用5%牛血清封閉20 min?？功?SMA抗體(1 ∶ 600)在4 ℃孵育過夜。在室溫下，用多克隆山羊抗兔免疫球蛋白/辣根過氧化物酶(1 ∶ 200)孵育30 min。光學顯微鏡下觀察切片，使用 Image-Pro Plus 6.0分析軟件進行分析。

1.3.5實時熒光PCR檢測α-SMA在肺組織中mRNA的表達 小鼠肺組織總RNA的提取用TRIzol試劑，然后用PrimeScript RT試劑盒反轉錄成cDNA。用SYBR預混劑進行擴增。α-SMA上游引物：5′-CCCAACTGGGACCACATGG-3′,下游引物5′-GAAGTTACAGGGGGCGTACAT-3′；GADPH上游引物：5′-CCCATGTTTGTGATGGGTGT-3′,下游引物：5′-TGGTGTCAGGTACGGTAGTG-3′。反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s和65 ℃ 30 s，30個擴增循環。根據2-△△CT公式計算α-SMA mRNA的相對表達量。

1.3.6Western blot檢測α-SMA、p-Akt、Akt 在肺組織中蛋白的表達 肺組織溶解于RIPA緩沖液中。勻漿冰上靜置30 min，離心(12 000 r·min-1，4 ℃，30 min)取上清。測定蛋白質濃度，以4 ∶ 1混于5×上樣緩沖液中，金屬浴15 min。配8%分離膠和5%濃縮膠進行蛋白凝膠電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶進行封閉，并在4 ℃孵育過夜:α-SMA(1 ∶ 1 000)和GAPDH(1 ∶ 2 000)，用含Tween的TBS洗3次，每次10 min，二抗(1 ∶ 10 000)在室溫下孵育2 h，TBST重復洗3次，ECL發光試劑盒顯影。用Imag J 分析條帶的積分光密度值。

2 結果

2.1 哮喘模型評估OVA激發后，哮喘組小鼠出現明顯的狂躁、易激惹、打噴嚏、流涕、呼吸頻率急促、體質量減輕等癥狀。對照組和IL-27治療組未見明顯變化。

2.2 HE染色對照組小鼠肺組織管腔完整，支氣管內無明顯炎性細胞浸潤，氣道平滑肌未見增厚；哮喘組可見支氣管腔狹窄，氣道和血管周圍可見明顯的炎性細胞浸潤；IL-27治療組較哮喘組明顯改善，炎性細胞明顯減少，但仍不能恢復到對照組的水平。哮喘組氣管壁厚度高于對照組(P<0.05)；IL-27治療組較哮喘組明顯下降, 但仍高于對照組, 差異有統計學意義(P<0.05),見Fig 1。

2.3 Masson染色Masson 染色結果顯示對照組肺組織可見少量藍色膠原，哮喘組和IL-27治療組較對照組支氣管上皮下膠原沉積明顯加重(P<0.05)，且 IL-27組上皮下膠原沉積情況較哮喘組明顯減輕(P<0.05),見Fig 2。

2.4 肺組織α-SMA的免疫組化結果免疫組化結果顯示，哮喘組小鼠肺組織α-SMA 陽性面積明顯高于對照組(P<0.01)，而IL-27治療后α-SMA陽性面積較哮喘組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見Fig 3。

2.5 肺組織α-SMA的mRNA和蛋白的表達結果在mRNA水平上，哮喘組小鼠α-SMA的表達量較對照組明顯升高(P<0.05),而IL-27治療組小鼠α-SMA的表達較哮喘組下降，差異有統計學意義(P<0.05)。在蛋白水平上，與對照組相比，哮喘組小鼠α-SMA的表達明顯增加，IL-27治療能明顯下調這一表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見Fig 4。

2.6 肺組織Akt蛋白表達采用Western blot對小鼠肺組織Akt蛋白的磷酸化水平進行檢測，結果顯示：與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織Akt磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，IL-27治療下調了Akt蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。Akt的總蛋白表達在3組間未見明顯的變化。因此IL-27可以抑制Akt蛋白的磷酸化，提示IL-27是通過PI3K/Akt通路抑制氣道重塑(Fig 4)。

A:HE staining of lung tissues at 400× magnification; B：The quantitative analysis of the thickness of airway wall.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOVA

A: Masson′s staining of lung tissue at (400×); B: The quantitative analysis of collagen deposition.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOVA

3 討論

哮喘是常見的呼吸系統疾病之一，發病率居高不下，影響到全球3億多人，每年大約有25萬人死亡。過去，人們認為氣道炎癥是導致氣道重塑的主要原因。大量的研究表明，氣道重塑不僅僅是慢性炎癥反應的結果，甚至與氣道炎癥同時存在。一些研究表明，IL-27 治療可減輕膠原誘導的關節炎[9]。IL-27能夠抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖、分化和膠原合成[10]。而且，IL-27通過調節Th17細胞的分化能夠減輕博萊霉素誘導的肺纖維化[11]。因此，我們推測IL-27能夠抑制哮喘小鼠的氣道重塑。

A: The expression of α-SMA in lung tissue were examined by immunohistochemistry (×400); B: The semiquantitative analysis of α-SMA.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsOVA

氣道炎癥是哮喘最主要的特征之一，炎癥細胞包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞等。炎癥細胞浸潤可促進氣道平滑肌細胞的增殖和遷移，氣道平滑肌的重塑是影響哮喘氣道重塑病理改變嚴重程度的重要因素，可釋放大量的細胞外基質蛋白，在受到刺激時也能夠促進炎癥細胞遷移。α-SMA不僅是氣道平滑肌的標志物, 而且在成纖維細胞以及上皮細胞向肌成纖維細胞轉化和活化的過程中起作用。此外，上皮下膠原過度沉積也是引起氣道重塑的重要特征。

本實驗成功構建哮喘小鼠氣道重塑模型，我們的研究顯示：IL-27能夠明顯抑制哮喘小鼠氣道平滑肌的增生、炎性細胞的浸潤，減少氣管及血管周圍膠原沉積面積。哮喘組小鼠α-SMA在氣道黏膜下大量沉積，且α-SMA在蛋白及mRNA水平表達明顯增高，而IL-27治療能明顯抑制哮喘小鼠α-SMA的表達。因此，本研究證明IL-27除了能夠抑制哮喘小鼠的氣道炎癥外還能抑制氣道重塑。

近年來，證據表明，PI3K/Akt信號通路在支氣管哮喘中發揮著重要作用。特異性PI3K抑制劑(LY294002)能顯著下調小鼠肺組織中Akt的磷酸化，抑制Th2細胞因子的產生、嗜酸性粒細胞浸潤、粘液的產生和氣道高反應性[12]。過表達miR-200a可能下調FOXC1，通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活，最終抑制哮喘患者的氣道平滑肌增殖和氣道重塑[13]。IL-27通過抑制Akt途徑，增強細胞毒性，誘導細胞凋亡，抑制卵巢囊腺癌細胞增殖[14]。IL-27通過激活PI3K/Akt信號通路，誘導支氣管上皮細胞表達趨化因子CXCL10[15]。然而，很少有研究報道IL-27與Akt信號通路在哮喘氣道重塑上的相關性。Akt作為PI3K的直接下游底物，可通過觀察p-Akt的表達來預測PI3K/Akt通路是否激活。在本實驗中，研究結果顯示，哮喘組小鼠p-Akt的表達明顯高于對照組，IL-27組能降低Akt的磷酸化水平。這些結果證實，IL-27通過抑制PI3K/Akt通路而抑制哮喘小鼠的氣道重塑。

綜上所述，本實驗證明IL-27對哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑有抑制作用，其機制是通過抑制PI3K/Akt通路。IL-27與氣道重塑之間的關系的深入研究，可能為我們治療頑固性哮喘提供新方向。

Fig 4 IL-27 inhibited expression of α-SMA and phosphorylation of Akt in asthmatic

A: The expression of α-SMA mRNA in the lung tissues were determined by RT-PCR; B: The expression of α-SMA, p-Akt and Akt was assessed by Western blot; C: The analysis of the α-SMA and p-Akt expressioprotein.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsOVA