松油烯-4-醇干預KLF4信號改善高糖誘導VSMCs氧化應激損傷的實驗研究

何 麗，黃 梅，楊彩琴，陳 娜，付凌云，蔣朝暉,3，王惠林，沈祥春，徐旖旎，張彥燕

(貴州醫科大學1. 藥學院臨床藥學教研室，2.天然藥物資源優效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省第一人民醫院，貴州 貴陽 550002；4.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

平，蛋白免疫印跡法檢測KLF4、Nrf2和HO-1的表達水平。進一步采用siRNA技術實現KLF4的敲低表達，檢測細胞活力、ROS水平，及其對Nrf2、HO-1蛋白表達的影響。結果松油烯-4-醇能夠抑制高糖誘導的VSMCs異常增殖，降低ROS水平，下調高糖誘導VSMCs中KLF4的表達，并上調抗氧化信號Nrf2、HO-1的表達。進一步研究表明，siKLF4轉染組明顯下調KLF4表達，抑制VSMCs增殖，降低細胞內ROS水平，并上調Nrf2、HO-1的表達水平。結論松油烯-4-醇對高糖誘導的VSMCs氧化應激損傷具有保護作用，其機制與其抑制核轉錄因子KLF4的表達，上調Nrf2/HO-1抗氧化信號軸有關。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)為血管中膜的主要細胞成分，在各種血管功能損傷中扮演著重要作用[1]?；钚匝跷镔|(reactive oxygenic species，ROS)生成和清除機制的失衡誘導細胞氧化應激損傷，為VSMCs結構和功能異常的重要病理過程[2-3]。研究表明，在氧化應激條件下，VSMCs可通過調節核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(nuclear factor erythroid-2-related actor 2/Heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)信號軸調控ROS誘導的氧化應激損傷[4-5]。因此，積極尋找靶向調控VSMCs氧化應激損傷的創新藥物，分析其分子信號機制能夠為臨床防治血管疾病提供新的治療靶點和策略。

松油烯-4-醇(terpinen-4-ol，T4O)為多數植物精油所含的單萜類成分。目前對其藥理活性研究主要集中于抗炎、抗腫瘤、抗菌等研究領域[6-7]，對血管平滑肌細胞的藥理學研究尚未見報道。KLF4(krüpple-like factor 4，KLF4)是具有鋅指結構的核轉錄因子，在細胞的增殖和分化中發揮重要作用[8-9]。本研究分析T4O對高糖誘導的VSMCs氧化應激損傷的保護作用，并基于KLF4信號進一步分析其作用機制，以期為臨床防治心血管疾病提供新的治療靶點和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株大鼠VSMCs購自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)細胞庫。

1.2 試劑T4O(山東西亞化學工業有限公司，純度≥98%，W33427)，DMEM(Gibco，8118374)，Nrf2多克隆抗體(proteinthch，16396-1-AP)，HO-1多克隆抗體(proteinthch公司，00071512)，KLF4 單克隆抗體(Cell Signaling Technology，12173S)，DMSO(Sigma公司，RNBF1060)，四甲基偶氮唑藍(索萊寶，804W059)，活性氧檢測試劑盒(Beyotime，S0033-1)，Lipofectamine 2000 Reagent(美國Invitrogen公司，2004957)，siRNA(上海吉瑪基因科技有限公司，KLF4 siRNA正義：5′-GGACUUUAUUCUCUCCAAUTT-3′，反義：5′-AUUGGAGAGAAUAAAGUCCTT-3′。對照siRNA正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。

1.3 藥物配制精密吸取T4O溶液(純度為98%)100 μL，溶于900 μL DMSO中，配成濃度為6×105μmol·L-1的母液，過濾除菌，-20℃保存。用時以DMEM培養基稀釋至不同工作濃度(DMSO濃度≤0.015‰)。

1.4 細胞培養及分組將復蘇的VSMC細胞轉入含10%胎牛血清、1%雙抗、100 μg·L-1FGF細胞因子的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中。根據實驗目的，實驗分為兩個部分，第一部分實驗分為5個組：正常對照組(Control，5.5 mmol·L-1葡萄糖)、模型組(Model，24.5 mmol·L-1葡萄糖)、T4O低劑量組(24.5 mmol·L-1葡萄糖+2.5 μmol·L-1T4O)、T4O中劑量組(24.5 mmol·L-1葡萄糖+5 μmol·L-1T4O)、T4O高劑量組(24.5 mmol·L-1葡萄糖+10 μmol·L-1T4O)。各給藥組預處理2 h后，加入高糖共同孵育24 h建立VSMCs氧化應激損傷模型。第二部分實驗分為4個組：正常對照組(Control，5.5 mmol·L-1葡萄糖)、模型組(Model，24.5 mmol·L-1葡萄糖)、siKLF4組(24.5 mmol·L-1葡萄糖+siKLF4)、siKLF4+T4O共給藥組(siKLF4+24.5 mmol·L-1葡萄糖+10 μmol·L-1T4O)。VSMCs接種于六孔板，待細胞生長密度為40%～50%時進行轉染。轉染組采用Lipofectamine 2000配制siRNA-lipofectamin復合物，VSMCs轉染6 h之后正常培養12 h，依據各實驗分組處理細胞。

1.5 MTT法測VSMC細胞活力將細胞以每毫升2×104個的密度接種于96孔板，采用MTT法檢測細胞活力。在本實驗中增加溶劑對照組(vechile，DMSO含量為0.015‰)，分析其對細胞存活率的影響。每組設6個平行孔，實驗重復3次。計算公式：細胞存活率/%=給藥組OD值/正常組OD值×100%。

1.6 DCFA-DA熒光探針檢測VSMC細胞ROS水平將VSMCs接種于6孔板中，各組分別按1.4項下第一部分及第二部分實驗分組處理24 h后，加入10 μmol·L-1的DCFA-DA熒光探針繼續培養30 min，無血清DMEM洗滌細胞2～3次，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 Western blot檢測分別收集各處理組的細胞，加入細胞裂解液(PMSF ∶ RIPA=1 ∶ 99)提取總蛋白，定量分裝后上樣。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉。加入一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加入二抗(1 ∶ 10 000)室溫孵育2 h。1×TBST洗膜3次，采用增強型化學發光液暗室顯影。

1.8 KLF4 siRNA干擾實驗VSMCs接種于六孔板，待細胞生長密度為40%～50%時按1.4項下第二部分實驗分組處理細胞，提取收集各處理組蛋白，檢測KLF4、Nrf2和HO-1蛋白表達。

2 結果

2.1 T4O抑制高糖誘導的VSMC細胞增殖MTT結果表明，給予高糖誘導24 h后促進細胞增殖(P<0.01)。給予不同劑量的T4O預孵育2 h后，能夠抑制高糖誘導的VSMCs增殖，且呈濃度依賴性。如Fig 1所示。

Fig 1 Inhibitory effect of terpinen-4-ol on proliferation of VSMCs induced by

Vehicle(0.015‰ DMSO),**P<0.01vsControl group;#P<0.05,##P<0.01vsModel group

2.2 T4O對細胞內ROS生成的影響采用DCFH-DA探針檢測VSMC細胞內ROS水平。結果表明，高糖誘導VSMC細胞內ROS水平增加，而T4O不同劑量組均能夠不同程度降低細胞內ROS水平，如Fig 2所示。

2.3 T4O對KLF4及Nrf2/HO-1信號蛋白表達的影響已有研究表明， KLF4表達與VSMCs的增殖密切相關，故本研究分析了T4O對高糖誘導的VSMCs中KLF4表達的影響。結果表明，模型組與正常組比較，KLF4蛋白水平明顯上調(P<0.05)，Nrf2和HO-1的表達明顯下調(P<0.05)。與高糖組比較，給予不同劑量的T4O干預后可明顯下調KLF4蛋白表達水平(P<0.01)，上調Nrf2、HO-1的蛋白表達(P<0.05)，如Fig 3所示。

2.4 siKLF4對VSMC細胞存活率及細胞內ROS水平的影響MTT結果顯示，轉染siKLF4能夠抑制高糖誘導的VSMCs增殖(P<0.01)，如Fig 4A所示。同時，采用DCFH-DA探針檢測VSMCs內ROS水平，siKLF4轉染組能夠降低細胞內ROS水平，如Fig 4B所示。以上結果表明，T4O可能通過抑制KLF4信號，降低高糖誘導的平滑肌細胞氧化應激損傷。

2.5 siKLF4對Nrf2/HO-1信號及KLF4蛋白表達的影響Western blot結果表明，與Control組比較，siKLF4組KLF4蛋白表達明顯下調(P<0.01)，敲低效率為52%，證明轉染成功，如Fig 5A所示。siKLF4轉染組及siKLF4+T4O共給藥組均能明顯上調Nrf2、HO-1表達水平(P<0.05)，組間比較差異無統計學意義，如Fig 5B所示。結果表明T4O能夠通過抑制KLF4信號，上調Nrf2/HO-1信號軸的活性，改善高糖誘導的平滑肌細胞氧化應激損傷，即表明T4O主要作用機制與KLF4信號相關，且KLF4為Nrf2/HO-1信號軸的上游調控分子。

3 討論

VSMC細胞異常增殖是血管重構的關鍵環節。研究表明，高糖可誘導VSMCs的增殖，介導動脈壁增厚和管腔狹窄，為血管損傷性重構的重要病理過程[10-11]。高糖損傷因素誘導ROS生成和氧化應激損傷，細胞內活性氧蓄積致氧化與抗氧化之間的平衡被打破，在超過抗氧化防御系統對其消除能力時，過多的氧自由基會直接或間接引起生物膜脂過氧化，從而導致組織的損傷[12]。Nrf2/HO-1信號軸是抗氧化應激反應中不可或缺的信號通路，其中Nrf2是協調抗氧化應激反應重要的轉錄因子，可以有效清除ROS[13]。KLF4作為調控VSMCs增殖與分化的強有力調節因子，研究表明，上調KLF4的表達可促進VSMCs增殖，而降低KLF4的表達則可抑制VSMCs增殖[14-15]。因此，本研究探尋高糖誘導的平滑肌細胞增殖及氧化應激損傷與核轉錄因子KLF4信號的相關性，并進一步分析KLF4信號是否能夠調控Nrf2/HO-1信號軸，從而抑制平滑肌細胞氧化應激損傷。

Fig 2 Terpinen-4-ol decreased ROS level in VSMCs induced by HG(×200)

Fig 3 Effect of terpinen-4-ol on KLF4 and Nrf2/HO-1 signal proteins of VSMCs induced by HG

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsModel group

A: Cell survival rate by MTT assay; B: Effect of KLF4 knockdown on ROS levels in HG-induced VSMCs.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsHG group

Fig 5 Effect of KLF4 siRNA on expression of Nrf2 and HO-1 protein after high glucose injury in VSMCs

A:Down-regulation of KLF4 after transfection of siKLF4 in VSMCs; B: KLF4 and Nrf2/HO-1 were detected by Western blot and normalized to GAPDH expression.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group

篩選有效的天然活性物質一直是防治心血管疾病的研究熱點。T4O是從芳香植物精油中提取的單體化合物，目前T4O的血管藥理學研究報道盡顯稀缺。因此，本研究以氧化應激損傷為切入點，分析T4O對高糖誘導VSMCs異常增殖及抗氧化能力的作用，對尋找具有自主知識產權的創新藥物具有重要意義。本研究表明，高糖孵育VSMCs細胞24 h誘導其增殖能力明顯增強，ROS水平明顯升高。而T4O低、中、高劑量組預處理可不同程度抑制VSMCs細胞的異常增殖，降低ROS的表達水平。蛋白免疫印跡結果進一步表明，T4O可下調高糖誘導VSMCs的KLF4蛋白水平，并上調Nrf2和HO-1抗氧化信號的水平。上述實驗提示，轉錄因子KLF4信號可能為T4O抑制高糖誘導的氧化應激損傷的潛在靶點，其機制可能與調控Nrf2/HO-1抗氧化信號軸有關。為了進一步分析KLF4信號與Nrf2/HO-1信號軸之間的關系，我們采用siRNA干擾技術實現KLF4的敲低表達， 結果證實T4O主要作用機制與KLF4信號相關，且KLF4為Nrf2/HO-1信號軸的上游調控分子。

本研究發現T4O對高糖誘導的血管平滑肌細胞氧化應激損傷具有保護作用，其調控機制與其抑制轉錄因子KLF4，上調Nrf2/HO-1抗氧化信號軸的水平有關，但T4O基于KLF4與Nrf2/HO-1信號軸的精密調節機制尚待進一步研究分析。