順鉑聯(lián)合小檗堿通過誘導(dǎo)DNA損傷和ROS依賴性凋亡抑制肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)

毛娟娟，程偉松，楊亦德，金 茜，汪佳兵

(臺(tái)州市立醫(yī)院 1.感染科、2.泌尿外科、3.藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤之首。由于早期缺乏常規(guī)檢查，多數(shù)患者被確診時(shí)已處于中晚期階段，很難通過手術(shù)完全根治[1]。經(jīng)典的細(xì)胞毒性藥物仍然是臨床上治療肺癌的主要選擇。在這一系列的細(xì)胞毒性藥物中，順鉑為代表的鉑類藥物是常見的化學(xué)治療藥物[2]。順鉑是目前臨床上治療肺癌的一線化學(xué)治療藥物，能夠誘導(dǎo)DNA損傷，抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。然而，順鉑會(huì)損害正常細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，從而限制了其臨床療效[3]。為了降低順鉑的副作用，腫瘤學(xué)家根據(jù)經(jīng)驗(yàn)開發(fā)了聯(lián)合化療方案。小檗堿(berberine，BBR)是從中藥黃連根莖中提取的一種異喹啉類生物堿，研究發(fā)現(xiàn)BBR具有抗微生物和抗炎等多種藥理活性[4]。目前，研究表明BBR對(duì)肝癌、前列腺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、白血病和乳腺癌等表現(xiàn)抗腫瘤作用[5]。目前BBR對(duì)肺癌的研究有部分報(bào)道，但順鉑聯(lián)合BBR對(duì)肺癌的抗腫瘤作用和機(jī)制尚無報(bào)道。因此，本文主要研究順鉑聯(lián)合BBR體外對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能存在的抗肺癌作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人肺癌A549細(xì)胞，購(gòu)自于上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 順鉑(貨號(hào)：P4394，Sigma公司)；小檗堿和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)(貨號(hào)：B107342和A105422，上海阿拉丁有限公司)；MTT、結(jié)晶紫、Triton X-100、多聚甲醛、DCFH-DA和DAPI(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)和0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)和胎牛血清(Gibico公司)；AnnexinV binding buffer、FITC AnnexinV Apoptosis及PI染色液(BD Biosciences Clontech)；γH2AX、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3和GAPDH(Cell Signaling Technology)。

1.1.3儀器 Spectra Max M2多功能酶標(biāo)儀(Molecular Device公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo美國(guó)熱電集團(tuán))；倒置顯微鏡(日本尼康公司)；低溫高速離心機(jī)(Thermo美國(guó)熱電集團(tuán))；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司); 細(xì)胞流式儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞用含90% RPMI 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100 U·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素培養(yǎng)。所有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞復(fù)蘇后傳代應(yīng)少于20代，且置于37 ℃、5% CO2的恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2MTT檢測(cè)A549細(xì)胞活力情況 取100 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞數(shù)約每孔8 000個(gè))，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，以讓細(xì)胞貼壁。次日更換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度的BBR(0、3、6、12、25、100、200 μmol·L-1)， BBR(8 μmol·L-1)與不同濃度的順鉑(0、2.5、5、7.5、10、15 μmol·L-1)，并且設(shè)置DMSO為陰性對(duì)照組。24 h后每孔加20 μL MTT。4 h后每孔再加150 μL DMSO，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置為490 nm測(cè)得OD值。生存率/%=給藥組OD/陰性對(duì)照組OD值×100%。

1.2.3細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549集落形成情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞1 mL分別接種到6孔板中，每孔含5×105個(gè)細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日更換新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞約8 d。用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，加入結(jié)晶紫染色液，用PBS清洗5次，并用相機(jī)拍照獲得圖像。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，1 mL接種到6孔板中，每孔含5×105個(gè)細(xì)胞，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日更換新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。加NAC組(5 mmol·L-1)需要提前孵育1 h再加藥，六孔板置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞上清液，用PBS洗1次，用0.5 mL胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，1 100 r·min-1離心4 min，棄上清用1 mL PBS重懸細(xì)胞，洗滌，1 100 r·min-1離心4 min，棄上清用 Binding buffer重懸細(xì)胞，加入至流式管中。每個(gè)流式管避光加入Annexin V，染色10 min后，再加PI染色5 min，然后加入Binding Buffer，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行收集檢測(cè)。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)A549細(xì)胞DNA損傷情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，將每孔約1×105個(gè)細(xì)胞置于免疫熒光小皿中至細(xì)胞貼壁，棄去舊培養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組，作用時(shí)間為12 h。用預(yù)冷PBS洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS洗3次，每次3 min；0.5% Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次，每次3 min；在小皿中滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；棄封閉液，不洗，每個(gè)小皿滴加足夠量一抗并放入濕盒，4 ℃孵育過夜； PBST洗3次，每次3 min；加熒光二抗?jié)窈兄惺覝胤跤? h，PBST洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染核，PBST洗3次，每次3 min；加入抗熒光猝滅劑，倒置熒光顯微鏡拍照。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)ROS情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞1 mL，含5×105個(gè)細(xì)胞，分別接種到6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日更換新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。棄上清培養(yǎng)基，用PBS洗1次，用饑餓培養(yǎng)基比例為1 ∶ 2 000稀釋加入DCFH-DA熒光探針，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，吸掉探針染色液，PBS洗滌，胰酶消化，加入培養(yǎng)基收集細(xì)胞。1 100 r·min-1離心3 min，棄上清用 PBS重懸細(xì)胞，1 100 r·min-1離心3 min，吸掉離心后液體，再加入PBS重懸。最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行收集檢測(cè)。

1.2.7Western blot法檢測(cè)A549細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞1 mL，含5×105個(gè)細(xì)胞，分別接種到6孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日更換新鮮培養(yǎng)基，設(shè)置對(duì)照組、BBR(8 μmol·L-1)組、順鉑(10 μmol·L-1)組和(BBR+順鉑)組。棄上清液，加入PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解緩沖液，搖勻后放在冰上裂解5 min，用蛋白刮刀刮取蛋白混懸液并收集在預(yù)冷的EP管中。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,測(cè)定蛋白濃度，制蛋白樣品。取蛋白，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜90 min。用5 %牛奶封閉1.5 h；用0.1% TBST洗膜3次，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗，4 ℃搖床過夜；用0.1% TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床孵1 h；用0.1% TBST洗膜3次，在ECL孵育顯影凝膠成像系統(tǒng)中成像。

2 結(jié)果

2.1 順鉑聯(lián)合BBR增強(qiáng)抑制A549細(xì)胞增殖如Fig 1A所示，相對(duì)于對(duì)照組，BBR能夠濃度依賴性地抑制A549生長(zhǎng)(P<0.01)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)8 μmol·L-1的BBR與不同濃度的順鉑聯(lián)合后也呈濃度依賴性地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.01)。其中，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，BBR(8 μmol·L-1)與10 μmol·L-1的順鉑聯(lián)用可顯著提高細(xì)胞毒性，細(xì)胞抑制率達(dá)到80%(Fig 1B)。因此，選擇8 μmol·L-1的BBR與10 μmol·L-1順鉑作為A549細(xì)胞聯(lián)合作用的濃度。

2.2 順鉑聯(lián)合BBR增強(qiáng)抑制A549細(xì)胞集落形成細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組和單藥組，聯(lián)合組能有效抑制A549細(xì)胞集落的形成(P<0.01)(Fig 2)。

2.3 順鉑聯(lián)合BBR增強(qiáng)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，8 μmol·L-1的BBR和10 μmol·L-1順鉑均能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，其中凋亡率分別為25.2%和15.2%。但當(dāng)兩藥聯(lián)合作用后，能明顯提高A549細(xì)胞的凋亡，凋亡率達(dá)到41.2%(P<0.01)(Fig 3A，3B)。為了進(jìn)一步說明聯(lián)合后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，Wwestern blot檢測(cè)Bcl-2和cleaved-caspase-3的表達(dá)。結(jié)果表明，相對(duì)于單藥組，聯(lián)合作用后能明顯抑制Bcl-2的表達(dá)和提高cleaved-caspase-3的表達(dá)(Fig 3C,3D)。

Fig 1 Effect of cispaltin combined with BBR on

**P<0.01vscontrol group

2.4 順鉑聯(lián)合BBR增強(qiáng)誘導(dǎo)A549細(xì)胞的DNA損傷為進(jìn)一步說明兩藥聯(lián)合后的抗腫瘤機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)DNA損傷進(jìn)行研究。結(jié)果如Fig 4A，4B，相對(duì)于對(duì)照組和單藥組，聯(lián)合作用后能明顯提高γH2AX蛋白的表達(dá)(P<0.01)。同時(shí)，相應(yīng)的免疫熒光實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，順鉑和BBR聯(lián)合作用后，能夠明顯提高γH2AX聚焦，見Fig 4C。

2.5 順鉑聯(lián)合BBR增強(qiáng)A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，如Fig 5A,5B，相對(duì)于對(duì)照組和單藥組，兩藥聯(lián)合作用后能明顯提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平(P<0.01)。

2.6 順鉑聯(lián)合BBR升高ROS促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡為了說明聯(lián)合用藥后升高的ROS能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞凋亡，細(xì)胞流式術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組和單藥組，順鉑聯(lián)合BBR明顯提高細(xì)胞凋亡率。但當(dāng)兩藥聯(lián)合ROS清除劑NAC后，細(xì)胞的凋亡率明顯下降(P<0.01)(Fig 6A,6B)。并且，Western blot實(shí)驗(yàn)也表明，相對(duì)于聯(lián)合組，使用NAC能夠提高Bcl-2的表達(dá)和降低cleaved-caspase-3的表達(dá)，說明了ROS介導(dǎo)順鉑聯(lián)合BBR的抗腫瘤作用(Fig 6C，6D)。

**P<0.01vscontrol group

3 討論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居惡性腫瘤之首，全球范圍內(nèi)，肺癌發(fā)生率不斷上升，危害日益嚴(yán)重，給人們的健康帶來了越來越多的壓力[1]。由于缺乏有效的早期診斷方法和明顯的早期癥狀，大多數(shù)肺癌患者被確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，不能通過手術(shù)切除等手段治療，化療是他們最主要的臨床治療策略[1]。目前隨著各種癌癥特異性分子生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，針對(duì)腫瘤特異性靶點(diǎn)的個(gè)體化治療逐漸成為肺癌藥物的開發(fā)熱點(diǎn)[5]。但靶向治療過程中不僅頻繁出現(xiàn)耐藥性，而且靶向藥物的治療費(fèi)用昂貴，這導(dǎo)致了靶向治療的受限[6-7]。另外，對(duì)于一些沒有潛在可行的分子靶點(diǎn)的肺癌患者，靶向藥物也不能用于治療[8-9]。因此，經(jīng)典的細(xì)胞毒性藥物已經(jīng)成為靶向治療受限及無效患者的首選。然而，細(xì)胞毒性藥物如順鉑具有胃腸道反應(yīng)、肝功能不全、腎衰竭、心血管并發(fā)癥等不良反應(yīng)[3]。因此，為了降低細(xì)胞毒性藥物的副作用，聯(lián)合用藥是目前研究的熱點(diǎn)。

在本文中，我們探討順鉑和BBR聯(lián)合后對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的抗腫瘤作用及相應(yīng)的抗腫瘤機(jī)制。我們初步使用MTT實(shí)驗(yàn)研究聯(lián)合用藥對(duì)A549細(xì)胞生存率的影響。結(jié)果表明，聯(lián)用相對(duì)較低劑量的BBR和順鉑可增強(qiáng)對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合能有效降低A549細(xì)胞集落的形成。細(xì)胞凋亡是基因介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡方式之一，對(duì)于消除各種生物系統(tǒng)中的有害細(xì)胞至關(guān)重要，并且是細(xì)胞毒性藥物的關(guān)鍵抗腫瘤機(jī)制[10]。我們的研究表明，相對(duì)于對(duì)照組和單藥組，順鉑和BBR聯(lián)合后能有效地誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。Bcl-2和caspase-3被公認(rèn)是在腫瘤發(fā)生中起重要作用的凋亡相關(guān)基因。本研究的Western blot結(jié)果表明，相對(duì)于單藥組，兩藥聯(lián)合能夠明顯抑制Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)提高cle-caspase3的表達(dá)，說明順鉑聯(lián)合BBR后通過增強(qiáng)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)起到協(xié)同作用。

研究表明，順鉑是細(xì)胞周期非特異性藥物，能夠誘導(dǎo)DNA損傷從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡。同時(shí)，相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，BBR也能夠直接與DNA結(jié)合后干擾DNA復(fù)制，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[11]，因此，BBR聯(lián)合順鉑可能通過增強(qiáng)DNA損傷，從而促進(jìn)A549細(xì)胞死亡。γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標(biāo)記物，在識(shí)別細(xì)胞內(nèi)DNA損傷、保持相關(guān)基因組的完整性和穩(wěn)定中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。本文研究表明，BBR與順鉑聯(lián)合能夠增強(qiáng)γH2AX蛋白的表達(dá)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的γH2AX熒光亮度增強(qiáng)。以上結(jié)果說明。BBR能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷，這或許是BBR增敏順鉑抗腫瘤的機(jī)制之一。

**P<0.01vscontrol group

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切有關(guān)[13]。其中，高水平的ROS能夠損傷脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[13]。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯高于正常細(xì)胞，這使得腫瘤細(xì)胞更加依賴抗氧化系統(tǒng)來維持自身的氧化平衡狀態(tài)，也使得腫瘤細(xì)胞對(duì)ROS的上升更為敏感，故通過升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的水平能夠在對(duì)正常細(xì)胞損傷較小的情況下，選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑和BBR聯(lián)用后明顯提高A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平。這與Youn等[15]報(bào)道順鉑和BBR聯(lián)用后提高Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平結(jié)果一致。我們也發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合使用NAC后，ROS被明顯降低。相應(yīng)的細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)也表明，在使用NAC后，順鉑和BBR聯(lián)用后A549細(xì)胞的凋亡率明顯降低。Western blot實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于聯(lián)合組，使用NAC能夠有效提高Bcl-2的表達(dá)和降低cleaved-caspase-3的表達(dá)，以上結(jié)果都說明了ROS參與順鉑聯(lián)合BBR的抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明，順鉑和BBR聯(lián)合后協(xié)同抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，此作用主要與增強(qiáng)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷和提高細(xì)胞內(nèi)的ROS水平有關(guān)。但目前本文主要在細(xì)胞層面上研究順鉑和BBR的聯(lián)合抗肺癌作用，需要進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索順鉑和BBR聯(lián)合的抗腫瘤作用和機(jī)制。

**P<0.01vscontrol group

Fig 5 Effect of cispaltin combined with BBR on ROS formation of A549 **P<0.01 vs control group

**P<0.001vscontrol group;##P<0.01vscispaltin+BBR group