MRL/lpr小鼠B淋巴細(xì)胞活化的免疫病理特征

江 麗，黃李娜，王盛付，王 祥，嚴(yán)尚學(xué)，魏 偉

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematous, SLE)是一種復(fù)雜的自身免疫介導(dǎo)的彌漫性結(jié)締組織病，其特點是大量自身抗體產(chǎn)生和多系統(tǒng)多器官的組織損傷[1]。SLE的病因是多因素和異質(zhì)性的，普遍認(rèn)為B細(xì)胞耐受破壞和異常激活是導(dǎo)致疾病的關(guān)鍵原因[2]。在B細(xì)胞的活化過程中，B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator factor, BLyS)對B細(xì)胞的存活、增殖、發(fā)育和分化起著關(guān)鍵作用[3]；白細(xì)胞介素IL-10(interleukin-10,IL-10)可以阻止B細(xì)胞凋亡，促進B細(xì)胞分化、增殖和MHCⅡ類分子表達，并可促進免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換[4]；IL-21可以促進B細(xì)胞的增殖分化和免疫球蛋白的生成[5]。同時，T細(xì)胞不同亞群如活化T細(xì)胞亞群、濾泡輔助T細(xì)胞(T follicular helper cell, TFH)亞群也在B細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮了重要作用。MRL/lpr小鼠是一種自發(fā)性的SLE模型小鼠，其血清學(xué)、組織病理學(xué)及免疫學(xué)等方面疾病特點與人類SLE臨床表現(xiàn)極為相似[6]。為了觀察SLE病程中B細(xì)胞異常活化的免疫病理改變，現(xiàn)比較了20周齡的MRL/lpr小鼠與同周齡的BALB/c小鼠的自身抗體水平、T/B淋巴細(xì)胞亞群比例、相關(guān)細(xì)胞因子水平以及腎臟和脾臟的病理變化，以更好地了解B細(xì)胞活化的免疫病理學(xué)改變參與紅斑狼瘡發(fā)病的機制。

1 材料與方法

1.1 動物雌性SPF級 MRL/lpr小鼠10只，體質(zhì)量25～35 g，購自上海斯萊克有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK(滬)2017-0005；雌性SPF級BALB/c小鼠10只，體質(zhì)量20～25g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)SPF實驗動物中心，合格證號：SCXK(皖)2017-001。

1.2 主要試劑FITC抗小鼠CD4抗體、Percp-5.5抗小鼠CXCR5 抗體、APC抗小鼠CD279 抗體、FITC抗小鼠CD19 抗體、PE抗小鼠CD138抗體、PE抗小鼠IL-17A抗體、PE抗小鼠CD62L抗體、PE-cy7抗小鼠CD69抗體(美國 BD 公司產(chǎn)品)；ANA、anti-dsDNA、BLyS、IL-10、IgG1、IgG2a等ELISA試劑盒(美國ADL公司)；C3一抗(美國proteintech)；DAPI(上海碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的測定 脫臼處死小鼠后剝離胸腺和脾臟，分別稱重，以每100 g動物體質(zhì)量的胸腺和脾臟重量作為動物的相應(yīng)胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

1.3.2熒光定量PCR檢測IL-21表達 用TRIzol從脾臟組織中提取1 μg總RNA合成cDNA，采用SYBR@Green Master Mix試劑進行擴增反應(yīng)。所有的聚合酶鏈反應(yīng)均使用特定的引物進行。用2-ΔCt法計算基因表達的倍數(shù)變化。小鼠引物序列如下，見表1。

表1 引物列表

1.3.3組織病理學(xué)檢查 取小鼠腎臟、脾臟，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察各組織病理改變情況。

1.3.4免疫熒光檢測免疫復(fù)合物C3的表達 腎臟石蠟切片脫蠟水化后，抗原修復(fù)液進行修復(fù)，BSA封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAPI染核10 min，加抗熒光淬滅劑，指甲油封片，最后在熒光顯微鏡下觀察C3的表達情況。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測T、B細(xì)胞亞群比例 常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為106個細(xì)胞/ml，分別加入FITC-CD4、Percy-5.5-CXCR5、PE-IL-17A、APC-CD279、FITC-CD19、PE-CD138、PE-cy7-CD69、PE-CD62L，4 ℃避光放置30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測TFH細(xì)胞(CD4+CXCR5+PD-1+)、Th17細(xì)胞(CD4+IL-17A+)、活化T細(xì)胞(CD4+CD69+)、幼稚T細(xì)胞(CD4+CD62L+)、總B細(xì)胞(CD19+)和漿細(xì)胞(CD19-CD138+)比例。

1.3.6ELISA法檢測血清中自身抗體與細(xì)胞因子水平 收集動物的血清，按照ELISA試劑盒檢測方法檢測自身抗體IgG1、IgG2a、anti-dsDNA、ANA水平和細(xì)胞因子BLyS、IL-10水平。

2 結(jié)果

2.1 小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)處死小鼠，解剖后肉眼可見MRL/lpr小鼠的胸腺和脾臟均比BALB/c小鼠大，由圖1A可知，與對照組比較，MRL/lpr小鼠胸腺指數(shù)升高[((0.18±0.20)vs(1.76±0.19),t=9.86,P<0.01]；圖1B結(jié)果提示，MRL/lpr小鼠脾臟指數(shù)高于對照組小鼠[(1.71±0.24)vs(0.53±0.032),t=5.86,P<0.01]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 細(xì)胞因子IL-21的基因表達水平小鼠脾臟中IL-21 mRNA檢測結(jié)果(圖1C)顯示，MRL/lpr小鼠脾臟中IL-21 mRNA水平高于BALB/c小鼠，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.04，P<0.01)。

圖1 小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及IL-21mRNA表達水平

A：胸腺指數(shù)；B：脾臟指數(shù)；C：IL-21 mRNA的相對表達量；與對照組比較，**P<0.01

2.3 小鼠腎臟、脾臟組織的病理學(xué)改變圖2結(jié)果顯示，正常小鼠(A1)腎小球輪廓清晰(a)，系膜細(xì)胞無增生(b)，模型小鼠(A2)腎小球體積增大(e)，系膜細(xì)胞增生(c)，系膜基質(zhì)增多，腎小球玻璃樣變性，局部中性粒細(xì)胞浸潤(d)，毛細(xì)血管基底膜略增厚，具有明顯的間質(zhì)性腎炎特征；正常小鼠(C1)腎小球幾乎沒有免疫復(fù)合物C3的表達(l)，模型小鼠(C2)腎小球免疫復(fù)合物C3沉積增多(k)；脾臟病理結(jié)果顯示，正常小鼠(B1)脾臟結(jié)構(gòu)清晰(g)，無增生，模型小鼠(B2)脾臟白髓彌漫性增生(i)，中央動脈管壁纖維性增厚，生發(fā)中心數(shù)量增多，紅髓白髓界限不明顯(h)。

圖2 小鼠組織病理學(xué)的改變

A1：正常小鼠腎臟(HE×400)；A2：模型小鼠腎臟(HE×400)；B1：正常小鼠脾臟(HE×200)；B2：模型小鼠脾臟(HE×200)；C1：正常小鼠腎小球免疫復(fù)合物C3表達(×400)；C2：模型小鼠腎小球免疫復(fù)合物C3表達(×400)

2.4 小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞亞群比例流式細(xì)胞術(shù)分別檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液中TFH細(xì)胞(CD4+CXCR5+PD-1+)、活化T細(xì)胞(CD4+CD69+)、Th17細(xì)胞(CD4+IL-17A+)、幼稚T細(xì)胞(CD4+CD62L+)、漿細(xì)胞(CD19-CD138+)和總B細(xì)胞(CD19+)亞群比例。圖3結(jié)果顯示，MRL/lpr小鼠脾臟組織的TFH細(xì)胞(圖3A)、活化T細(xì)胞(圖3B)、Th17細(xì)胞(圖3C)以及漿細(xì)胞(圖3E)比例升高；幼稚T細(xì)胞(圖3D)和總B細(xì)胞(圖3F)比例低于BALB/c小鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 小鼠血清中自身抗體水平和細(xì)胞因子水平表1結(jié)果可知，與對照組比較，MRL/lpr小鼠自身抗體IgG1、IgG2a、anti-dsDNA、ANA水平以及細(xì)胞因子BLyS和IL-10水平均升高。

3 討論

SLE是一種慢性、系統(tǒng)性自身免疫病，機體對自身的耐受性下降導(dǎo)致大量自身抗體的產(chǎn)生[7]是疾病發(fā)生的主要原因。目前研究[8]認(rèn)為，SLE與B淋巴細(xì)胞過度活化、分化有著密切的關(guān)聯(lián)。B淋巴細(xì)胞是機體內(nèi)主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，不僅能產(chǎn)生致病性自身抗體，而且作為抗原呈遞細(xì)胞，為T細(xì)胞的活化和分化提供共刺激信號，介導(dǎo)固有免疫和體液免疫[8]。

在B細(xì)胞活化過程中，T細(xì)胞各亞群發(fā)揮了重要作用。B細(xì)胞接受相應(yīng)抗原或多克隆刺激劑刺激后，生發(fā)中心(germinal center，GC)的TFH細(xì)胞通過CD40L、IL-21、PD-1、BLyS等多種途徑提供細(xì)胞存活和增殖信號給B細(xì)胞，刺激GC中B細(xì)胞進行超頻突變，然后選擇成功的GC B細(xì)胞進入下一輪發(fā)育[9]。在TFH細(xì)胞的作用下，這個誘導(dǎo)增殖、選擇細(xì)胞的過程不斷反復(fù)，會產(chǎn)生大量的B細(xì)胞，并最終形成完整的GC。TFH細(xì)胞除了促進GC的形成，還可以通過Fas-FasL信號清除GC中的B細(xì)胞，以維持GC的正常功能[10]。在本研究中，MRL/lpr小鼠T細(xì)胞大量活化，幼稚T細(xì)胞(CD62L)比例下降，活化T細(xì)胞(CD69)比例升高，且TFH細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比增加，其相應(yīng)分泌的IL-21、IL-17水平升高，進一步促進了GC的形成；此外，MRL/lpr小鼠體內(nèi)血清IL-10水平也升高，SLE患者的IL-10血清水平升高且與疾病活動程度相關(guān)[11]，其對B細(xì)胞的存活、增殖、分化和自身抗體的產(chǎn)生有積極影響，也維持和促進了B細(xì)胞的發(fā)育分化；同時，由于MRL/lpr小鼠Fas基因的缺失抑制了TFH細(xì)胞通過Fas-FasL信號介導(dǎo)的B細(xì)胞凋亡，造成B細(xì)胞凋亡不足、大量活化并最終分化為漿細(xì)胞。

表1 小鼠血清中IgG1、IgG2a、anti-dsDNA、ANA、BLyS和IL-10水平

與對照組比較，**P<0.01

圖3 T、B淋巴細(xì)胞亞群比例

A：TFH細(xì)胞；B：活化T細(xì)胞；C：Th17細(xì)胞；D：幼稚T細(xì)胞；E：漿細(xì)胞；F：總B細(xì)胞；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

本研究結(jié)果顯示，MRL/lpr小鼠的漿細(xì)胞比例升高，其產(chǎn)生的血清IgG1、IgG2a、anti-dsDNA和ANA等自身抗體水平高于對照組小鼠，anti-dsDNA、ANA作為SLE疾病活動期的特征性自身抗體[12]，表明MRL/lpr小鼠B細(xì)胞已大量分化為漿細(xì)胞，B細(xì)胞比例減少，這一現(xiàn)象與文獻報道的SLE 活動期患者B 細(xì)胞亞群紊亂，主要表現(xiàn)為漿細(xì)胞比例增加，CD19+B細(xì)胞比例減少相一致[13]。脾臟病理結(jié)果也觀察到MRL/lpr小鼠脾臟白髓彌漫性增生，腎臟呈現(xiàn)了間質(zhì)性腎炎特征以及大量C3免疫復(fù)合物的沉積。這些大量免疫復(fù)合物又作為自身抗原刺激機體的髓樣樹突細(xì)胞并產(chǎn)生高水平的BLyS，進一步促進了B細(xì)胞的發(fā)育和GC的形成，導(dǎo)致了B細(xì)胞活化的惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致了疾病的發(fā)生。