雷公藤甲素通過抑制細胞色素P450 3A4酶增強肝損傷研究

楊新華，夏宏光，金 涌

雷公藤(tripterygium wilfordii hook F，TWHF)是一種藤本植物，TWHF的粗提物已被廣泛用作治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病的處方[1]，如類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、IgA腎病、狼瘡性腎炎、腎小管間質性腎炎、系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)并對組織和器官移植有益[2]。雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱雷公藤內酯醇，是從TWHF的粗提取物中分離的復合三環氧化物二萜。作為TWHF的主要生物活性成分之一，它在體外和體內均具有獨特的生物活性。然而在TP達到其臨床潛力之前，仍然需要克服眾多問題，如水溶性差、治療窗口狹窄和多器官毒性(包括損害消化系統、泌尿生殖系統、血液循環系統以及骨髓)。長期使用可導致嚴重的不良事件，如肝腫大、丙氨酸氨基轉移酸(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)升高等[3]。目前TP誘發肝臟損傷的確切作用機制尚不明確。細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是一組結構和功能相關的超家族基因編碼的同工酶，主要存在于生物體的內質網內，是混合功能氧化酶中最重要的一種酶系[4]。CYP3A 酶有3A4、3A5、3A7和3A43 4個亞型[5]，成人CYP3A酶分別占肝臟和小腸總P450酶的40%和80%，以3A4為主[6]。CYP3A酶參與機體內源性物質和外源性物質的生物轉化，在調節機體與外環境的相互作用以及保持機體內環境穩態中發揮重要作用[7]。CYP3A酶活性受多種因素影響，例如遺傳多態性、機體生理或病理狀態以及合并用藥情況，尤以遺傳多態性最為顯著。TP在大鼠肝微粒體中代謝主要由CYP3A介導。該文主要研究TP對其主要代謝酶CYP3A4的影響以及與肝損傷之間的關聯性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株與動物 L-02細胞購自中國科學院上海細胞庫。生長于含10%胎牛血清培養液中，在37℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱內換液傳代培養，實驗均采用對數期細胞。24只C57BL/6雄性小鼠(6～8周，18～20 g)購自安徽醫科大學動物實驗中心，小鼠的飼養環境為SPF級動物房，室溫20～25 ℃，濕度為40%～60%，每籠2只。

1.1.2主要試劑 TP(成都普思生物)；卡馬西平(carbamazepine, CBZ)(上海阿拉丁)、氨氯地平(amlodipine，AML)(上海阿拉丁)、甲醇(色譜純) 購自上海化學試劑總廠；RPMI 1640培養基購自美國 Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma 公司；β-actin抗體和山羊抗兔 IgG均購自北京博奧森科技有限公司；CYP3A4抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司； ALT、AST檢測試劑盒購自南京建成公司。

1.1.3主要儀器 全波長酶標儀(美國Biotek公司)；顯影儀(上海歐翔科學儀器有限公司)；色譜柱：Shim-pack ODS C18柱，4.6 mm×250 mm，高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1MTT法篩選CBZ(CYP3A4酶誘導劑)、AML(CYP3A4酶抑制劑)[8]和TP對L-02細胞株的生長抑制率 取消化后的L-02細胞，以每孔1×104個細胞密度接種于96孔板。觀察細胞貼壁后加入藥物CBZ，濃度分別為25、50、60、70、80、90、100、110、120 μmol/L，每組做6個復孔，再取消化后的L-02細胞，以每孔1×104個細胞密度接種于96孔板。觀察細胞貼壁后加入藥物AML，濃度分別為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 μmol/L，每組做6個復孔，再取消化后的L-02細胞，以每孔1×104個細胞密度接種于96孔板。觀察細胞貼壁后加入藥物TP，濃度分別為23、24、25、26、27、28、29、30、31 nmol/L, 每組做6個復孔。加藥刺激24 h。并于實驗結束后均加入MTT(5 mg/ml)20 μl并繼續培養4 h。將上清液倒掉，每孔再加入DMSO 200 μl，震蕩至溶解完全，以酶標儀測定490 nm吸光度。

1.2.2細胞實驗分組及對肝細胞存活的影響 取消化后L-02細胞，以每孔5×105個細胞密度接種于6孔板。觀察細胞貼壁后將細胞分為C組、TP組、TP+CBZ組、TP+AML組。C組加入少量DMSO作空白對照，TP組加入23 nmol/L的TP，TP+CBZ組加入23 nmol/L的雷公藤甲素和25 μmol/L的CBZ，TP+AML組加入23 nmol/L的TP和10 μmol/L的AML，作用24 h。貼壁細胞的收集用不含有乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化(胰酶消化的時間不易過長，否則易引起假陽性)，1 000 r/min 離心5 min后收集，用PBS洗滌細胞3次，收集細胞(1～5)×105個，然后加入100 μl的Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，最后加入2 μl Propidium Iodide，充分混勻。避光、室溫37 ℃、反應時間5～15 min，在1 h內，使用流式細胞儀進行檢測。并單獨收集各組細胞的培養液用于檢測。

1.2.3動物實驗分組 取24只C57BL/6雄性小鼠(6～8周)，喂養1周適應環境后分別喂食正常飼料、TP(0.6 mg/kg/d)、TP(0.6 mg/kg/d)+AML(1.0 mg/kg/d)、TP(0.6 mg/kg/d)+CBZ(24 mg/kg/d)，喂食2周后安樂死，取血清、肝臟。

1.2.4小鼠蘇木精-伊紅(HE)染色 將活組織用4%多聚甲醛溶液固定后包埋在石蠟中。將切片(4 μm)用蘇木精(5%)染色10 min。首先將組織切片在蒸餾水中漂洗、酸化，然后在伊紅中染色5 min。脫水和蓋玻片安裝后，在明視野顯微鏡下觀察組織切片。

1.2.5ALT、AST的檢測 按照試劑盒說明書用酶標儀測定各組L-02細胞上清液和小鼠血清中AST、ALT的含量。

1.2.6CYP3A4 mRNA的檢測 采用RT-PCR法，首先按照takara試劑盒說明書提取4組L-02細胞及小鼠肝臟的RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進行擴增反應，反應體系為20 μl。

CYP3A4上游引物：5′-GCACCGAGTGGATTTCCTTC-3′;下游引物：5′-CGTGGTTTCATAGCCAGCAA-3′。β-acting上游引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′,下游引物：5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′。以β-actin為內參，采用2-△△Ct計算mRNA表達量，實驗重復3次。

1.2.7CYP3A4的Western blot分析 采用Western blot 法，收取4組L-02細胞和小鼠肝臟并加入RIPA細胞裂解液提取蛋白質，1 ∶4加入5X上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上SDS-PAGE電泳分離蛋白質，半干轉法將蛋白質轉移至 PVDF 膜;5%脫脂奶粉封閉;滴加CYP3A4一抗(CYP3A4抗體，兔，武漢三鷹，1 ∶1 000；β-actin抗體，小鼠，中杉金橋，1 ∶1 000),4 ℃過夜;加入適當稀釋度的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 標記的二抗(山羊抗兔辣根過氧化物酶，中杉金橋，1 ∶5 000),室溫孵育2 h,然后TBST洗滌3次;加入 ECL曝光液,曝光顯影后,使用 Image J 軟件進行條帶分析。

1.2.8TP含量檢測 取L-02細胞上清液和小鼠血清，加入地西泮溶液作為內標溶液，溶劑為甲醇，流動相為甲醇 ∶水(50 ∶50)，流速1 ml/min，柱溫40 ℃，檢測波長217 nm。精密吸取200 μl內標液(0.5 μg/ml)于玻璃試管中，40 ℃氮氣吹干。先后于此玻璃管中加入2 ml培養液，渦旋混合3 min，1 200 r/min離心5 min，取上清液后加入1 ml乙酸乙酯，靜置分層后，12 000 r/min離心30 min，離心后取上清液，用氮氣吹干，溶解于100 μl甲醇中，取20 μl進樣。

2 結果

2.1 MTT實驗結果不同濃度的CBZ對L-02細胞的抑制率如圖1A所示，不同濃度的AML對L-02細胞的抑制率如圖1B所示，不同濃度的TP對L-02細胞的抑制率如圖1C所示，但在選擇藥物對細胞作用的最佳濃度時，應考慮到細胞存活率這個影響因素，若細胞存活率過低，提示藥物對細胞造成過度損傷，過度損傷的細胞再用藥物進行作用，效果不明顯。故本研究最終選擇CBZ的藥物作用濃度為25 μmol/L，AML的藥物作用濃度為10 μmol/L,TP的藥物作用濃度為23 nmol/L，因為這個藥物濃度對L-02細胞的損傷作用較小，L-02細胞的存活率較高。

2.2 藥物聯合應用后各組細胞凋亡率如圖2所示，在L-02細胞中單獨加入TP后與正常組相比細胞凋亡率升高，加入CYP3A4酶誘導劑TP+CBZ 組細胞凋亡率與TP組相比有所降低，但仍高于正常組的凋亡率，CYP3A4酶抑制劑的TP+AML組細胞凋亡率與TP組相比有所升高。

圖1 MTT實驗結果

A：CBZ；B：AML；C：TP；0 nmol/L比較：**P<0.01

2.3 各組細胞上清的ALT、AST含量使用試劑盒檢測細胞培養液中的ALT、AST結果如圖3所示，在圖中可以看出TP+AML且中的AST、ALT含量最高，說明抑制劑組的L-02細胞損傷最為嚴重，其次是TP組，再然后是TP+CBZ組。

圖2 各組細胞凋亡結果 A: 細胞流式圖；B：凋亡定量分析圖；C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

圖3 各組細胞上清AST和ALT含量

A：各組細胞上清AST含量；B：各組細胞上清ALT含量；C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

2.4 各組肝臟細胞CYP3A4 mRNA和蛋白質表達水平定量PCR結果表明，TP明顯下調肝臟細胞CYP3A4 mRNA表達，CBZ顯著拮抗TP對肝臟細胞CYP3A4 mRNA表達的下調效應，而AML進一步加劇TP對肝臟細胞CYP3A4 mRNA表達的下調效應(圖4A)。Western blot結果顯示，TP明顯下調肝臟細胞CYP3A4 蛋白質表達，CBZ顯著拮抗TP對肝臟細胞CYP3A4 蛋白質表達的下調效應，而AML進一步加劇TP對肝臟細胞CYP3A4 蛋白質表達的下調效應(圖4B)。

2.5 各組細胞上清中TP的含量高效液相色譜結果顯示，該方法的校正曲線公式為Y=503.5X-0.564(R2=0.999)。高效液相色譜圖結果如圖5，各組培養基中剩余TP的含量如表1，結果顯示TP+AML組中TP的含量最高，TP+CBZ組中TP的含量最低。

表1 各組中剩余TP含量

與TP組比較：*P<0.05

圖4 聯合用藥后各組CYP3A4 mRNA和蛋白表達水平

A：CYP3A4 mRNA水平；B：CYP3A4蛋白表達水平；C: 正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

2.6 小鼠肝臟HE染色結果與血清AST、ALT的含量HE染色結果顯示TP+AML組肝臟損傷最為嚴重，AST及ALT的含量最高。其次是TP組，程度最輕的是TP+CBZ組。見圖6。

2.7 各組小鼠肝臟中CYP3A4的mRNA及蛋白表達水平結果顯示TP+AML組的CYP3A4的mRNA及蛋白表達最低，其次是TP組，降低最少的是TP+CBZ組。見圖7。

2.8 各組小鼠血清中TP的含量高效液相色譜結果顯示各組小鼠血清中TP的含量如表1，結果顯示TP+AML組中TP的含量最高，TP+CBZ組中TP的含量最低。

3 討論

既往研究[9]表明，TP可通過多種機制引起肝損傷，如誘導細胞凋亡、誘導氧化應激、誘導誘導型一氧化氮合酶表達、引起免疫損傷等，其中CYP450代謝異常是藥物性肝損傷的主要發病機制之一[10]。一項關于肝臟小鼠模型的研究[11]報道，肝臟CYP450的失活抑制了肝臟中的TP代謝，導致該化合物的生物利用度和毒性增加。

圖5 高效液相色譜圖

A：未添加；B：添加TP；C：添加地西泮；D：添加地西泮和TP；1：地西泮(內標)；2：TP

CYP450酶參與大多數異生化合物的生物轉化[12]。CYP3A4是CYP450的一種亞型，TP主要被CYP3A代謝[10]。CYP3A4不僅參與了TP的代謝，TP對它還有一定的抑制作用[13]。本研究以正常肝細胞L-02 和C57BL/6雄性小鼠為對象，探討CYP3A4在TP對肝損傷中的作用。

圖6 肝臟HE染色結果與血清AST、ALT的含量

A： HE染色結果×200(空泡代表肝臟損傷)；B:小鼠血清中AST含量；C: 小鼠血清中ALT含量； C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

本研究的體內外實驗結果顯示TP對L-02細胞和C57BL/6雄性小鼠的CYP3A4的表達均有明顯的抑制作用，與此同時，TP對L-02細胞和C57BL/6小鼠肝臟均有損傷作用。加入CYP3A4抑制劑AML后，CYP3A4的表達進一步減少，TP含量明顯增加，提示TP代謝降低，其結果是TP對L-02細胞以及小鼠肝臟的損傷增大；與之相反，加入CYP3A4誘導劑CBZ后，CYP3A4的表達明顯增加，TP含量明顯降低，提示TP代謝加速，產生的結果是TP對L-02細胞和小鼠肝臟的損傷則顯著降低。

圖7 聯合用藥后各組CYP3A4的蛋白及mRNA結果

A：CYP3A4 mRNA水平；B：CYP3A4蛋白表達水平；C: CYP3A4/β-actin； C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

由上述結果可能得出結論，TP通過抑制了CYP3A4的表達，減慢自身代謝，因而造成對了肝臟的損傷，但是否是產生肝損傷的主要機制還有待下一步的實驗證明。