低頻重復經顱磁刺激對甲基苯丙胺成癮大鼠復吸行為、記憶功能和海馬結構的影響

徐曉津，房茂勝，繆 楹，徐艷芩

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)俗稱“冰毒”，是2000年以后我國毒品濫用中最具代表性、最常見且濫用增長速度最快的毒品，其起效迅速，口服后數分鐘即可表現出明顯的中樞和外周反應，且半衰期較長[1-2]。有研究[3]報道稱小劑量使用MA可促進長期智力發展，而長時間大量使用MA會嚴重損傷機體，降低認知功能，嚴重者會導致死亡。現階段研究[4]表明氧化應激、神經元凋亡、興奮性毒性都參與到MA的神經毒性過程中。低頻重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)作為一種新發展的神經電生理技術，其在改善抑郁癥患者認知功能方面效果得到了肯定，但目前rTMS防治MA戒毒后復吸的相關研究鮮少報道。該研究旨在通過構建MA自身給藥模型，給予rTMS治療，來觀察rTMS防治MA復吸的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源健康雄性SD大鼠60只，體質量200～220 g，購于中國食品藥品檢定研究院[許可證號：SCXK(京)2017-0005]，所有SD大鼠均飼養在中國檢驗檢疫科學研究院屏障環境動物房[SYXK(京)2016-0011]，培育室溫度20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，進行人工光照(12 h/12 h)，大鼠全天自由飲水，常規飼料飼養。實驗過程中均嚴格遵循“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器MA(購自中國藥品生物制品鑒定所，批號171212)；Mag Pro30型經顱磁刺激儀(丹麥Dantec公司)；RB-100A水迷宮測試系統(北京新天地科技有限公司)；大鼠自身給藥訓練籠及相關配件(寧波市俺來科技有限公司)。

1.3 實驗動物分組與MA自身給藥模型建立將60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組，每組20只。所有大鼠適應性飼養7 d后，用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后同時給予0.3 mg/kg的阿托品鎮靜；將大鼠固定于手術臺上，快速分離出右側靜脈，并剪出“V”字型切口，然后用長度3.5 cm的PE50插管沿切口迅速插入，醫用尼龍線固定，并在靜脈遠心端結扎，在插管的另一端用10 cm長的PE20經皮下組織由背部穿出體外，并用消毒過的堵頭封口，手術后每天通過插管給予0.1 ml的肝素鈉抗凝，并在術后3 d內給予2×105U的青霉素抗感染，所有大鼠單籠飼養，全天自由飲食。手術完成后恢復7 d左右，對模型組和實驗組大鼠進行MA自身給藥訓練，采用固定比例程序進行訓練，每天訓練3 h，將大鼠放入訓練籠中，亮起籠燈，大鼠在訓練籠中的碰觸有效鼻觸，籠燈熄滅，完成1次有效鼻觸可獲得1次0.05 mg/kg劑量的MA給藥，給藥時間過程持續5 s，每次給藥后會有20 s不應期，不應期內僅記錄有效鼻觸次數但不進行給藥，結束后亮起籠燈，進入下一個循環。訓練時間持續8 d，以連續3 d有效鼻觸次數超過50次，且變化幅度低于10%，判定為模型建立成功[5]。

1.4 rTMS治療方法將各組大鼠放置在長圓型塑料器具中固定，使大鼠的頭頸部皮膚緊貼在內徑10 mm、外徑60 mm的MC125圓形線圈正中心，調整輸出場強在3.7 T，保持刺激強度為1 T，頻率為1 Hz，連續刺激25次后間隔2 min繼續刺激，一共5個序列，每天1次，對照組和模型組大鼠，僅用線圈緊貼頭部，但不給予刺激，共持續治療7 d，每天均在20：00進行試驗。

1.5 行為學試驗

1.5.1曠野實驗 采用文獻[6]中相關方法，在rTMS治療后將大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的內空敞箱中，將箱子內壁涂成黑色，且底部用黑線劃分為面積相等的25塊，記錄大鼠穿越地面方塊數作為水平活動得分，直立次數則作為垂直得分。測試過程中周圍保持安靜，且每只大鼠完成試驗后，清理平臺及氣味，避免對后面大鼠的實驗造成影響。

1.5.2水迷宮實驗 采用文獻[7]中的相關方法，在曠野實驗結束后開始進行，RB-100A水迷宮測試裝置有棕黑色塑料板制成，水深度為22 cm，將裝置分為A區、B區、C區、終點區，在終點區位置有臺階能夠讓實驗動物爬出水面，A、B、C區到終點區均進行訓練，每個區域訓練3次。訓練完成后，記錄5 min內實驗動物從C區起點處進入終點區所需時間以及進入盲端次數(錯誤次數)，24 h后復測1次。

1.6 大鼠復吸行為檢測將經過rTMS治療后的大鼠放入飼養籠，觀察其完成自然戒斷后，再次放入自身給藥實驗籠中，進行3 h的訓練，開始訓練前給予1次條件性刺激，即燈籠、鼻觸紅燈以及注射泵開啟聲音，但不給予MA注射，之后每次有效鼻觸反應均可獲得1次條件性刺激，但同樣不給予MA注射，記錄大鼠實驗過程中的有效鼻觸反應和無效鼻觸反應次數。

1.7 大鼠海馬組織病理變化情況觀察將完成行為學試驗后的各組大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后側腹朝上固定，剪開胸腔將心臟完全暴露出來，用注射針插入左心室心尖處，剪開右心耳，通過注射泵注射含20 IU/ml肝素的生理鹽水，待流出液無血色后，用4%多聚甲醛溶液灌流，發現軀體變白、僵硬后于冰上迅速斷頭處死，剝離海馬組織后，用10%甲醛固定3 d后，用石蠟包埋后制成5 μm厚的切片。

1.7.1HE染色觀察海馬組織 將制備好的切片經二甲苯脫蠟2次后，用從高到低的梯度乙醇透明，蘇木精染色5 min，鹽酸分化15 s，流水返藍15 min，伊紅染色2 min，在用從低到高的梯度乙醇脫色，二甲苯脫水透明后封片，利用Olympus光學顯微鏡觀察海馬組織病理形態學變化，并拍照記錄。

1.7.2尼氏染色觀察海馬組織 將制備好的切片用去離子水洗滌2次，2 min/次，用提前配制好的尼氏染色液染12～15 min，完成后再次用去離子水清洗2次、30 s/次，95%乙醇脫水2次、2 min/次，二甲苯脫水透明2次、5 min/次，完成后用中性樹膠封片，利用Olympus光學顯微鏡觀察海馬組織病理形態學變化，并拍照記錄。

1.7.3電鏡下觀察海馬CA3區突觸超微結構 利用KBL III型超薄切片機先切取1 μm半薄切片觀察定位后，繼續切取75 nm的超薄切片，用醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色后，在H-800型透射電鏡下觀察并拍照記錄用于分析大鼠神經突觸的面數密度、面積密度和體積密度情況。

2 結果

2.1 rTMS對MA大鼠曠野實驗的影響與對照組相比，模型組大鼠曠野實驗的水平及垂直得分均降低；與模型組向比，實驗組大鼠水平及垂直得分均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠曠野實驗結果比較(分，

與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 rTMS對MA大鼠水迷宮實驗的影響與對照組相比，模型組和實驗組大鼠水迷宮學習及記憶任務完成時間延長，錯誤次數增多，而實驗組大鼠水迷宮學習、記憶任務完成時間要短于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，但錯誤次數差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠水迷宮實驗結果比較

與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 rTMS對條件線索誘導大鼠MA復吸行為的影響與自然戒斷前相比，條件線索誘導后模型組大鼠有效鼻觸次數減少，但差異無統計學意義(P>0.05)，實驗組大鼠有效鼻觸數降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，條件線索誘導后實驗組大鼠有效鼻觸數降低，差異有統計學意義(P<0.05)，無效鼻觸數差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 模型組與實驗組大鼠復吸行為情況比較(次，

與自然戒斷前比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.4 rTMS對MA大鼠海馬組織病理學影響HE染色結果顯示：對照組大鼠海馬細胞排列整齊緊密，細胞大小均一，細胞核明顯，模型組大鼠可見海馬細胞排列分散，形態不規則，部分細胞細胞核明顯變小甚至消失，實驗組大鼠海馬細胞結構基本正常，排列較為整齊，細胞核變形情況較少。見圖1。

尼氏染色結果顯示：與對照組大鼠相比，模型組和實驗組大鼠尼氏小體數目和平均光密度均降低，與模型組大鼠相比，實驗組大鼠尼氏小體數目和平均光密均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.5 rTMS對MA大鼠突觸超微結構的影響醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色結果顯示：對照組大鼠海馬CA3區神經突觸數量多，結構清晰，突觸前成分中可見數量較多且排列緊密的圓形突觸小泡(圖3A中黑色箭頭所指)，模型組大鼠海馬CA3區神經突觸數量明顯減少，突觸前、后膜有融合情況，突觸小體較為松散，且數量也明顯減少(圖3B中黑色箭頭所指)，實驗組大鼠海馬A3區突觸數量較對照組少，模型組多，突觸前、后膜之間可見少量融合，分界線較為清晰(圖3C中黑色箭頭所指)。與對照組相比，模型組大鼠CA3區神經突觸面數密度、面積密度及體積密度均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，實驗組大鼠CA3區神經突觸面數密度、面積密度降低，差異有統計學意義(P<0.05)，體積密度差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組相比，實驗組大鼠CA3區神經突觸面數密度、面積密度及體積密度均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬CA3區突觸相關指標比較

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

靜脈自身給藥MA模型，作為目前國際公認的一種能夠有效模擬人類主動吸食MA的模型，通過完整的給藥獲得、維持、戒斷、消退及條件線索誘導復吸過程，能夠為MA成癮的研究提供很好的參考作用[8]。本研究為了探討rTMS對MA依賴大鼠復吸行為的影響，在自然戒斷過程中給予了持續7 d的rTMS治療，與開始自然戒斷前相比，治療后的MA大鼠有效鼻觸數明顯減少，表明rTMS治療能夠有效干預條件線索誘導的MA復吸行為。可能是因為rTMS作為一種非侵入生物刺激技術，對于神經系統功能有較大的影響，有研究表明，rTMS能夠影響神經遞質水平，降低多巴胺水平[9]，而腹側背蓋區投射到伏隔核及前額葉皮層的中腦-邊緣多巴胺獎賞系統環路是MA成癮及復吸的關鍵神經通路[10]，因此推測rTMS可能是通過抑制多巴胺水平，阻滯中腦-邊緣多巴胺獎賞系統環路，從而干預了MA大鼠復吸行為。

圖1 各組大鼠海馬組織的HE染色結果 ×400

圖2 各組大鼠海馬組織的尼氏染色結果 ×100

曠場實驗能夠通過觀察實驗動物在新環境下的特定行為發生頻率和持續時間來反映實驗動物的自主行為及探索行為，而這一過程與人類的復雜情緒變化類似，因此常用于實驗動物海馬功能的測試[11]。水迷宮實驗作為研究海馬功能相關的空間學習記憶的檢測手段，可有效反映動物的空間學習記憶能力[12]。對MA成癮大鼠進行曠野實驗及水迷宮實驗發現，其曠野實驗的水平及垂直得分明顯降低，水迷宮實驗的學習、記憶時間顯著變長，錯誤次數也顯著增多，表明MA能夠顯著損傷大鼠的神經學習記憶能力，而經過rTMS治療后，曠野實驗的水平及垂直得分明顯升高，且與正常大鼠沒有明顯差異，而水迷宮的學習、記憶時間雖然明顯縮短，但還是要高于對照組，且錯誤次數沒有明顯變化，這表明雖然rTMS能夠一定程度的改善MA引起的神經損傷，但由于MA引起神經損傷的機制較為復雜，因此僅通過rTMS治療是無法完全恢復的。有研究[13]表明，突觸前突觸素(synap tophysin，Syn)作為研究突觸可塑性最常用的1個指標，rTMS治療后，腦缺血大鼠海馬組織中Syn表達水平顯著升高，突觸后致密物質(postsynaptic density，PSD)作為中樞突觸結構可塑性的重要指標，與學習、記憶的訓練及保持能力關系密切，缺血時會引起PSD厚度減少，而rTMS治療后，可明顯增加PSD厚度，改善突觸界面曲率和穿孔性突觸比率，進而改善大鼠的學習記憶功能[14]，因此推測rTMS可能是通過促進MA大鼠海馬組織中Syn表達水平及改變PSD厚度，來改善MA引起的神經學習記憶功能損傷。同時對各組大鼠海馬組織結構進行光鏡和電鏡觀察結果發現，MA大鼠海馬細胞損傷較為嚴重，尼氏小體及平均光密度均顯著降低，CA3區神經突觸數量減少，突觸前、后膜融合，突觸小泡數量減少，均表明MA對神經元產生了損傷，但經過rTMS治療后，神經元損傷明顯改善，且突觸形態學參數也有所改善，但尚未達到正常水平，可能是突觸可塑性改變速度相對較慢，與白冰 等[15]研究一致。

綜上所述，rTMS可有效干預MA大鼠的復吸行為，并且還可能通過改善大鼠的突觸可塑性來緩解MA對大鼠神經海馬組織的損傷及學習記憶功能的影響。但rTMS改善MA神經毒性作用的具體機制尚不清楚，還需要進一步探討。