新生小鼠七氟醚暴露對(duì)其青春期記憶及突觸可塑性的影響

王加侖，廉海光，林鳳顏，李 建

在動(dòng)物模型中研究[1-2]表明，新生期一些麻醉劑的暴露可導(dǎo)致長(zhǎng)期認(rèn)知功能和記憶障礙。而在新生兒期-幼兒期臨床麻醉的研究的結(jié)果中存在爭(zhēng)議，有研究[3]認(rèn)為麻醉劑對(duì)認(rèn)知無(wú)影響，而大部分研究[4-6]表明麻醉劑可導(dǎo)致多種神經(jīng)認(rèn)知障礙，尤其是在有麻醉史的患兒，其發(fā)育和行為呈現(xiàn)出一定的缺陷。這種結(jié)果的不同可能來(lái)源于麻醉劑型、麻醉深度、麻醉時(shí)間、麻醉史和個(gè)體的差異。另外，部分麻醉造成的認(rèn)知功能損傷能在麻醉術(shù)后恢復(fù)[7]，因此，探索麻醉劑對(duì)神經(jīng)發(fā)育的長(zhǎng)期效應(yīng)更有助于新生兒期麻醉應(yīng)用的管理。七氟醚為新生兒科常用的吸入性麻醉劑。現(xiàn)采用6～7 d齡新生小鼠，給予三階段七氟醚暴露，在2月齡時(shí)通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及突觸的可塑性，從而闡明新生期小鼠七氟醚暴露對(duì)發(fā)育期學(xué)習(xí)記憶能力及突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57/BL6新生鼠(6～7 d齡)購(gòu)自海南省藥物研究所[SCXK(瓊)2015-0007]，飼養(yǎng)于海南省藥品檢驗(yàn)所的相對(duì)濕度45%～55%、每天光照12 h條件下的SPF動(dòng)物房[SYXK(瓊)2016-0009]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)海南省藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.HNYJS201811043)。

1.1.2主要試劑 抗腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)抗體(#sc-1012)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)抗體(#ab58962)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.1.3主要儀器 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(型號(hào)：SA201)和條件與關(guān)聯(lián)條件恐懼分析系統(tǒng)(型號(hào)：SA897)購(gòu)自江蘇賽昂斯生物科技有限公司；社會(huì)交互三箱實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)(型號(hào)：SX152)購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司；單細(xì)胞膜片鉗記錄分析系統(tǒng)(型號(hào)：MutiClamp 700B)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠七氟醚暴露與分組 30只新生鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和七氟醚暴露組，每組15只。對(duì)照組不進(jìn)行麻醉暴露；七氟醚暴露組：新生鼠放入保溫盒中，控制溫度在36 ℃，本研究模擬臨床麻醉狀態(tài)，采用三階段遞減濃度的七氟醚進(jìn)行麻醉，首先，用3.5%七氟醚麻醉30 min，然后用3%七氟醚麻醉30 min，最后用2.5%七氟醚麻醉30 min，共1.5 h。麻醉期間用氣體分析儀監(jiān)測(cè)保溫盒內(nèi)二氧化碳和七氟醚濃度。麻醉結(jié)束后回籠，2月齡時(shí)進(jìn)行后續(xù)的行為學(xué)等實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Morris水迷宮測(cè)試 水迷宮中加入二氧化鈦使水混濁，水溫控制在20 ℃。將小鼠從不同位置放入水池，記錄小鼠找到平臺(tái)的潛伏期，將平臺(tái)撤去，記錄小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)以及在平臺(tái)象限停留時(shí)間。

1.2.3三箱交互行為學(xué)測(cè)試 三箱裝置中每個(gè)側(cè)室均有一個(gè)圓形塑料籠，實(shí)驗(yàn)包括四個(gè)階段，每次持續(xù)10 min。在第一階段，小鼠被限制在中間室；第二階段，允許小鼠自由探索；第三階段，在兩側(cè)的籠中分別放入陌生小鼠1及黑色立方體，允許小鼠探索10 min；第四階段，將黑色立方體替換成陌生小鼠2。記錄小鼠社交互動(dòng)時(shí)間。

1.2.4關(guān)聯(lián)性恐懼與條件恐懼測(cè)試 在恐懼實(shí)驗(yàn)中，小鼠被放入條件反射室中，用3 Hz頻率聲音刺激20 s和電刺激1 s，記錄小鼠聽(tīng)到聲音時(shí)靜止次數(shù)。關(guān)聯(lián)性恐懼為將小鼠放入反射室中小鼠靜止次數(shù)。

1.2.5BDNF及Caspase-3免疫組化 鼠腦組織經(jīng)4% PFA固定、30%蔗糖脫水、石蠟包埋后5 μm切片，先用枸椽酸鈉高溫修復(fù)后，過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，之后以1 ∶200稀釋比例孵育Ⅰ抗體(BDNF及Caspase-3)，4 ℃過(guò)夜。次日，PBS洗滌后用HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，之后用DAB顯色液顯影后顯微鏡拍照。利用Image J軟件對(duì)BDNF及Caspase-3的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6全細(xì)胞膜片鉗記錄微小興奮性突觸后電流 小鼠斷頭取腦，預(yù)冷人工腦脊液灌注后振動(dòng)機(jī)片機(jī)作300 μm海馬區(qū)域冠狀切面腦片，室溫恢復(fù)30 min后放入記錄箱，用人工腦脊液持續(xù)灌流，在顯微鏡下尋找海馬區(qū)GABA能神經(jīng)元。GABA能神經(jīng)元一般呈卵圓形，長(zhǎng)軸約10 μm。并且通過(guò)兩種方法挑選出GABA能神經(jīng)元，首先，GABA能神經(jīng)元相對(duì)于其它神經(jīng)元有較小的膜電容及膜時(shí)間常數(shù)，其次，GABA能神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic current, mEPSC)有更快的運(yùn)動(dòng)幅。將GABA能神經(jīng)元挑出，將細(xì)胞鉗制在-70 mV，并用300～400 pA電流刺激50 ms，記錄mEPSC峰值電流與頻率。

2 結(jié)果

2.1 小鼠在新生期七氟醚暴露可損傷青春期空間定位的記憶能力通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究小鼠在新生期七氟醚暴露對(duì)青春期(2月齡)空間定位的記憶能力的影響。對(duì)照組第1～5天小鼠尋找平臺(tái)的延遲時(shí)間(逃避潛伏期)分別為(78.79±9.25)、(31.25±3.56)、(18.67±5.12)、(13.24±4.56)和(18.12±4.78)s，七氟醚暴露組第1～5天小鼠逃避潛伏期分別為(82.36±2.56)、(67.84±7.52)、(58.79±5.44)、(48.24±1.49)和(43.24±3.14)s；與對(duì)照組比較，七氟醚暴露組第2～5天小鼠尋逃避潛伏期顯著增加(F=93.325，P<0.01)，見(jiàn)圖1A。與對(duì)照組(197.74±10.25)mm/s比較，七氟醚暴露組小鼠的游泳速度(209.36±11.23)mm/s，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.432，P=0.785)，見(jiàn)圖1B。與對(duì)照組(40.62±2.23)%比較，七氟醚暴露組小鼠在平臺(tái)象限的時(shí)間百分比(23.45±5.12)%顯著縮短(t=8.689，P<0.001)，見(jiàn)圖1C。與對(duì)照組(13.25±0.61)比較，七氟醚暴露組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)(6.16±0.84)顯著減少(t=11.372，P<0.001)，見(jiàn)圖1D。

圖1 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期空間定位的記憶能力

A：兩組小鼠的逃避潛伏期；B：兩組小鼠的平均游泳速度；C：兩組小鼠在平臺(tái)象限的時(shí)間百分比；D：兩組小鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)；1.對(duì)照組; 2.七氟醚暴露組；與對(duì)照組比較：**P<0.01,***P<0.001

2.2 小鼠在新生期七氟醚暴露可損傷青春期恐懼記憶多次實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，七氟醚暴露組小鼠條件性恐懼記憶曲線斜率顯著增加(P<0.05)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力，見(jiàn)圖2A。但在單次實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組(48.36±5.23)%比較，七氟醚暴露組小鼠靜止次數(shù)百分比(32.14±3.76)%顯著降低(t=11.325，P<0.001)，表明小鼠的關(guān)聯(lián)性恐懼記憶減少，見(jiàn)圖2B；與對(duì)照組(83.24±6.36)%比較，七氟醚暴露組小鼠靜止次數(shù)百分比(57.35±5.43)%顯著降低(t=11.325，P<0.001)，表明條件性恐懼記憶降低，見(jiàn)圖2C。

圖2 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期

A：兩組小鼠多次實(shí)驗(yàn)的條件性恐懼記憶斜率曲線；B：兩組小鼠單次實(shí)驗(yàn)的關(guān)聯(lián)性恐懼記憶；C：兩組小鼠單次實(shí)驗(yàn)的條件性恐懼記憶；與對(duì)照組比較：*P<0.05,***P<0.001

2.3 小鼠在新生期七氟醚暴露可損傷青春期社交記憶采用三箱實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小鼠在新生期七氟醚暴露對(duì)青春期(2月齡)的社交記憶的影響。在陌生小鼠1-空籠實(shí)驗(yàn)中，與空籠(50.23±4.36)s比較，七氟醚暴露組小鼠與陌生小鼠1社交互動(dòng)時(shí)間(148.74±11.25)s明顯增加(圖3A、3B，t=9.654，P<0.001)；同樣，與空籠(54.76±7.28)s比較，對(duì)照組小鼠與陌生小鼠1社交互動(dòng)時(shí)間(151.28±10.04)s明顯增加(圖3A、3B，t=10.344，P<0.001)，表明兩組在陌生小鼠1-空籠實(shí)驗(yàn)中小鼠均無(wú)社交障礙。在陌生小鼠1-陌生小鼠2實(shí)驗(yàn)中，七氟醚暴露組小鼠對(duì)陌生小鼠1(37.23±4.36)s與陌生小鼠2(40.35±2.16)s的社交互動(dòng)時(shí)間無(wú)差異(圖3A、圖3C，t=0.664，P=0.753)；而對(duì)照組小鼠與陌生小鼠2的社交互動(dòng)時(shí)間(88.16±7.34)s高于陌生小鼠1(35.38±4.28)s(圖3A、3C，t=12.932，P<0.001)，表明七氟醚可明顯損害小鼠的社交記憶。

圖3 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期社交記憶

A： 三箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果的示意圖；B：陌生小鼠1-空籠實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的社交互動(dòng)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與陌生小鼠1比較：***P<0.001；C：陌生小鼠1-陌生小鼠2實(shí)驗(yàn)中兩組小鼠的社交互動(dòng)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與陌生小鼠2比較：***P<0.001

2.4 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期海馬區(qū)域BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目且增加凋亡細(xì)胞數(shù)目BDNF免疫組化染色結(jié)果(圖4A、4B)顯示，與對(duì)照組(100.00±9.32)%比較，七氟醚暴露組海馬組織中BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比(44.28±5.14)%顯著降低(t=10.43，P<0.001)。Caspase-3免疫組化染色結(jié)果(圖4C、4D)顯示，與對(duì)照組(3.24±1.02)比較，七氟醚暴露組海馬組織單位mm2中Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(35.42±4.71)顯著增加(t=16.533，P<0.001)。

2.5 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期海馬GABA能神經(jīng)元mEPSC的頻率與幅度通過(guò)全細(xì)胞記錄GABA能神經(jīng)元mEPSC(圖5A)，如圖5B所示，與對(duì)照組(4.34±0.26)Hz比較，七氟醚暴露組mEPSC頻率(2.78±0.31)Hz明顯降低(t=6.332，P<0.01)；如圖5C所示，與對(duì)照組(13.26±1.25)pA比較，七氟醚暴露組mEPSC的峰值電流(9.14±0.89)pA明顯降低(t=5.645，P<0.01)。

圖4 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期海馬區(qū)BDNF

A：兩組小鼠海馬區(qū)BDNF免疫組化標(biāo)記代表圖；B：兩組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：兩組小鼠海馬區(qū)Caspase-3免疫組化標(biāo)記代表圖；D：兩組海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。與對(duì)照組比較：***P<0.001

3 討論

目前，雖然關(guān)于麻醉劑對(duì)神經(jīng)發(fā)育的研究結(jié)果存在爭(zhēng)議[3-6]，但麻醉劑暴露與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程之間必然存在密切關(guān)系。在本研究中，小鼠在新生期七氟醚暴露可明顯損害其青春期的空間定位的記憶能力、恐懼記憶及社交記憶。本研究中，雖然七氟醚暴露的小鼠在條件性恐懼記憶過(guò)程中的學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)，但這并不能表明新生鼠的七氟醚暴露與神經(jīng)損害之間無(wú)關(guān)聯(lián)。而既往研究[8]顯示七氟醚暴露造成條件性恐懼記憶過(guò)程中的學(xué)習(xí)能力減弱，這研究結(jié)果與本研究具有差異，造成結(jié)果差異的原因可能是既往研究[8]采用3%七氟醚麻醉新生鼠6 h，而本研究利用七氟醚濃度遞減模型模擬大部分臨床麻醉狀態(tài)，麻醉深度相對(duì)較淺。

圖5 小鼠在新生期七氟醚暴露可降低青春期GABA能神經(jīng)元mEPSC頻率與峰值電流

A：全細(xì)胞膜片鉗記錄兩組小鼠GABA能神經(jīng)元的mEPSC；B：兩組小鼠mEPSC頻率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C：兩組小鼠mEPSC峰值電流的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與對(duì)照組比較：**P<0.01

本研究進(jìn)一步對(duì)新生鼠七氟醚暴露對(duì)突觸可塑性的影響進(jìn)行了探索。BDNF是腦內(nèi)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在調(diào)控突觸可塑性過(guò)程中有重要作用，且與學(xué)習(xí)和記憶具有密切聯(lián)系[9]。有研究[10]表明，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病及發(fā)育障礙的小鼠模型中BDNF明顯下降。麻醉藥物可引起的術(shù)后認(rèn)知障礙，而激活BDNF的翻譯能逆轉(zhuǎn)這種認(rèn)知障礙[11]。本研究結(jié)果顯示，七氟醚可明顯抑制海馬神經(jīng)元BDNF表達(dá)。Caspase-3在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙中起重要作用，且有研究[12]表明神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的小鼠神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中Caspase-3表達(dá)升高。另外，已有研究[13]表明，新生鼠七氟醚暴露可抑制海馬及杏仁核神經(jīng)元再生，且可誘導(dǎo)海馬及皮層的神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，七氟醚可明顯促進(jìn)海馬神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)。因此，本研究證實(shí)了七氟醚對(duì)新生鼠的海馬神經(jīng)元的損害作用。神經(jīng)元功能障礙一般表現(xiàn)為mEPSC的頻率與幅度的降低[14]。而本研究結(jié)果表明新生鼠七氟醚暴露可明顯降低GABA能神經(jīng)元mEPSP的頻率及幅度。