利用MALDI-TOF MS檢測鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥性的研究

李蓉蓉，方亞平，李亞娟，沈繼錄，3

致病菌的快速鑒定與藥敏結果的獲得能夠指導臨床抗生素的針對性用藥，從而提高病人的生存率[1]。傳統的檢測方法主要是培養、生化實驗、分子診斷等,費用昂貴，人力需求大[2]。目前，實驗室新興了一種對病原菌的檢測方法：基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser resolutionu ionization time-of-flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS)。該技術結果可靠，鑒定快速，成本低[3]。基于此，科研人員逐漸將目光放在對細菌耐藥性的應用上[4-6]。替加環素是FDA 批準用于治療感染性疾病的抗生素，現已出現了部分替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌[7]，其耐藥機制復雜[8]，目前，對替加環素敏感性的檢測主要通過K-B法及MIC法，其耗時長，因此，該研究將通過利用MALDI-TOF MS技術建立快速檢測替加環素耐藥性的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 隨機收集安徽醫科大學第一附屬醫院2016～2019年間保存的107株鮑曼不動桿菌。

1.1.2試劑與儀器 MALDI-TOF MS質譜儀(德國Bruker公司)；無菌96孔板(上海生工有限公司)；替加環素(美國惠氏公司)；胰蛋白胨(英國OXOID公司)；酵母提取物(英國OXOID公司)；NaCl(國藥集團化學試劑北京有限公司)；麥康凱平板、哥倫比亞血平板、MH平板(合肥天達有限公司)；替加環素紙片(英國OXOID公司)；超純水，96孔靶板(德國Bruker公司)；MALDI-TOF MS配套試劑包括α-氰基-4-羥基肉桂酸 (德國Bruker公司)；多肽標準品(德國Bruker公司)；無水乙醇(上海沃凱生物技術有限公司)；乙腈(天津市化學試劑供銷公司)；甲酸(天津市化學試劑供銷公司)；三氟乙酸(天津市化學試劑供銷公司)均為分析純。

1.1.3軟件 Bruker質譜儀配套軟件MALDI Biotyper3.0、FlexControl3.0及WHONET5.6。

1.2 方法

1.2.1細菌復蘇 將107株細菌從-20 ℃冰箱取出四區劃線接種于麥康凱平板，置于35 ℃恒溫培養箱培養18～24 h，從麥康凱平板上挑取單個菌落接種于血平板上，再置于35 ℃恒溫培養箱培養18～24 h。

1.2.2MALDI-TOF MS鑒定細菌 將血平板上培養18～24 h后長出的純菌落用甲酸/乙腈法處理，采用MALDI-TOF MS技術鑒定，每株細菌點3個靶點，每個靶點打3張圖譜，圖譜由FlexControl 3.0軟件手動獲取。

1.2.3藥敏試驗 先利用K-B法檢測鮑曼不動桿菌敏感性，游標卡尺測量抑菌圈(≤12 mm為耐藥，13～15 mm為中介，≥16 mm為敏感)，結果顯示敏感的菌株視為對替加環素敏感，對替加環素非敏感菌株再利用微量肉湯稀釋法復查，結果判讀采用美國FDA推薦的折點判讀標準(MIC≤2 mg/l為敏感，4 mg/l是中介，≥8 mg/l為耐藥)[9]，采用替加環素耐藥株及敏感株構建數據庫。

1.2.4自建庫及算法分析 上述微量肉湯稀釋法檢測的敏感和耐藥鮑曼不動桿菌的圖譜導入MALDI Biotyper 3.0、去掉低質量圖譜(score<2.3)。隨機選出20株替加環素耐藥鮑曼不動桿菌及20株替加環素敏感菌株導入MALDI Biotyper 3.0建立數據庫，余下鮑曼不動桿菌的圖譜用于驗證。

1.3 統計學處理將替加環素耐藥株和敏感株的圖譜導入MALDI Biotyper 3.0利用PCA聚類分析進行同源性分析。利用WHONET5.6軟件統計不同型別細菌的藥物敏感性。

2 結果

2.1 細菌鑒定及藥敏結果107株細菌經MALDI-TOF MS鑒定結果為：103株鮑曼不動桿菌、3株瓊氏不動桿菌、1株醫院不動桿菌，鑒定分數均>2.0。103株鮑曼不動桿菌利用K-B法檢測對替加環素敏感性，結果為敏感的有10株、耐藥有54株、中介有39株。對K-B法結果為非敏感的93株鮑曼不動桿菌進行微量肉湯稀釋法檢測，結果顯示為敏感的有29株、耐藥有37株、中介有27株，兩種方法的一致率為68.82%(64/93)，替加環素敏感及耐藥的鮑曼不動桿菌質譜圖見圖1。利用WHONET 5.6對37株替加環素耐藥的泛耐藥鮑曼不動桿菌的科室分布進行統計分析，其中干部呼吸內科6株、急診ICU 8株、重癥監護室10株、心外科3株、急診外科、心內科、干部神經內科均2株、肝膽胰外科、呼吸內科、神經外科、胸外科均1株。

圖1 替加環素敏感和替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌質譜圖

圖2 76株鮑曼不動桿菌的同源性關系圖

2.2 同源性分析結果將微量肉湯稀釋法確定為替加環素敏感和耐藥的76株鮑曼不動桿菌的圖譜進行同源性分析，可將76株鮑曼不動桿菌明顯分為2大簇4個分型，見圖2。分別命名為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅱ，將泛耐藥鮑曼不動桿菌定義為對包括替加環素及常規抗菌藥物均耐藥的鮑曼不動桿菌，這4種型別中對泛耐藥鮑曼不動桿菌的比例分別為0%(0/10)、50%(8/16)、44.83%(13/29)、71.42%(15/21)。利用WHONET5.6軟件統計出4種型別鮑曼不動桿菌對19種抗生素的耐藥率，結果見表1，顯示4種型別鮑曼不動桿菌對常規應用抗生素出現高耐藥率，對米諾環素、替加環素和多黏菌素B的耐藥率較低。對上述泛耐藥鮑曼不動桿菌進行統計，結果顯示，急診ICU、急診外科、心外科、重癥監護室均有Ⅰ、Ⅱ型泛耐藥鮑曼不動桿菌，干部呼吸內科、干部神經內科出現Ib、Ic型，肝膽胰外科、神經外科僅有Ib型、呼吸內科僅有Ic型，心內科、胸外科僅有Ⅱ型菌。

2.3 自建庫結果40株菌共得到280張(去掉80張低質量圖譜)圖譜建立替加環素敏感和耐藥的鮑曼不動桿菌數據庫，利用自建庫檢測余下36株鮑曼不動桿菌的256張圖譜(去掉77張低質量圖譜)，對替加環素耐藥的鮑曼不動桿菌的正確檢出率為87.4%，替加環素敏感菌株的正確檢出率為77.5%。

表1 四種型別鮑曼不動桿菌對不同藥物的藥敏結果統計

表格內“-”代表相應抗生素無統計結果

3 討論

本實驗中，鮑曼不動桿菌對替加環素的耐藥率為35.92%(37/103)。出現這一高耐藥性可能原因可能是收集菌株大部分多來源于急診科同源性較強，并且入院感染患者多屬于重癥感染患者，耐藥菌感染率高。替加環素屬于高級抗生素，出現對此藥耐藥后，感染的治療會變得困難，并且多次抗生素誘導后敏感性細菌也可產生耐藥性[10]。因此，臨床感染的治療需要合理應用抗生素，降低耐藥菌的產生。

本研究中，K-B法和微量肉湯稀釋法的一致率為68.82%，這種低一致率提示K-B法不能作為鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥性檢測的標準。將微量肉湯稀釋法結果作為參考，自建庫對替加環素敏感及耐藥鮑曼不動桿菌的分類正確率分別為77.5%、87.4%。研究發現[11-12]，實驗環境、預處理過程等均可影響圖譜結果，因此出現上述結果的可能原因包括以下幾點：① 數據庫較小，本課題組僅應用20株細菌建庫；② 培養環境、預處理過程等影響MALDI-TOF MS圖譜；③ 不同菌株用于驗證的圖譜數不等影響驗證結果；④ 鮑曼不動桿菌耐藥機制復雜，將所有耐藥鮑曼不動桿菌歸為一個庫后檢測效率低。因此，對于一個新的數據庫的建立，可擴大實驗菌株，并控制所有菌株的實驗條件，以提高數據庫的準確率。兩個自建庫的結果正確率分別為77.5%、87.4%，提示通過自建庫預測鮑曼不動桿菌對替加環素的敏感性也可能成為細菌敏感性檢測的新方法。

此外，37株替加環素耐藥的泛耐藥鮑曼不動桿菌的科室分布統計顯示泛耐藥鮑曼不動桿菌主要集中在急診ICU、干部呼吸內科及重癥監護室(64.9%)，其余則少量分布在急診外科、心內科、干部神經內科、肝膽胰外科、呼吸內科、神經外科、胸外科。上述數據提醒這些科室目前需要嚴格的消毒滅菌，控制院內感染的爆發。

利用MALDI-TOF MS進行同源性分析在之前文獻也有出現[13]，但結果不如PFGE法準確，尚在探索研究階段，不作為流行病學統計分析的推薦方法。同源性分析結果顯示，Ⅱ型泛耐藥鮑曼不動桿菌的檢出比例最高，占71.42%，Ia型未見泛耐藥鮑曼不動桿菌，所以同源性分析可用于初步篩選替加環素耐藥的泛耐藥不動桿菌。統計顯示各型鮑曼不動桿菌對氨芐青霉素、氨芐青霉素-舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、頭孢噻肟、哌拉西林、美羅培南均顯示高耐藥率，對米諾環素、替加環素、多黏菌素B的耐藥率出現差別，Ia型鮑曼不動桿菌對替加環素耐藥率為0%，可用替加環素治療Ia型鮑曼不動桿菌的感染，神經外科僅有Ib型，該型鮑曼不動桿菌對多黏菌素B的耐藥率為0%，因此，該型鮑曼不動桿菌感染后可用多黏菌素B治療。而急診ICU、急診外科、心外科、重癥監護室均有Ⅰ、Ⅱ型耐替加環素鮑曼不動桿菌存在，說明這幾個科室可能存在交叉感染。

綜上所述，MALDI-TOF MS可快速鑒定鮑曼不動桿菌、瓊氏不動桿菌、醫院不動桿菌，同源性分析可篩查泛耐藥鮑曼不動桿菌，自建庫可預測鮑曼不動桿菌對替加環素的耐藥性，這為臨床實驗室檢測細菌的藥物敏感性提供了一種新的思路。