血小板反應蛋白-1對人牙周膜成纖維細胞表達IL-6及COX-2的影響

劉笑笑，沈振國，趙榮權，邢 田，侯愛兵

慢性牙周炎是口腔常見的細菌感染性疾病，已成為成人牙齒缺失的重要原因。口腔微生物感染為始動因子，可直接造成牙周組織破壞，也可引發宿主免疫反應和炎癥反應，釋放大量炎癥介質、細胞因子，間接造成牙周組織破壞。血小板反應蛋白(thrombospondin,TSP)-1是Baenziger et al[1]1971年從凝血酶激活的血小板α顆粒中分離出來的糖蛋白，繼而發現多種類別的細胞均可表達[2]。近年來研究[3]發現，TSP-1在感染和炎癥免疫性疾病中具有促炎抗炎、調節免疫、局部組織重建等重要作用。2014年Gokyu et al[4]發現，深牙周袋的患者的牙齦組織，TSP-1 mRNA的表達水平要高于淺的牙周袋和正常牙周的牙齦組織。

現通過絲線結扎法構建大鼠牙周炎模型[5]，檢測大鼠牙齦組織中TSP-1的表達水平。分離培養原代人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblast, hPDLFs)，通過添加重組TSP-1蛋白(recombinant TSP-1 protein, rTSP-1)或過表達TSP-1質粒至hPDLFs，觀察hPDLFs表達白細胞介素(interleukin，IL)-6，環氧酶(cyclooxygenase, COX) -2的變化，從而進一步探討TSP-1在慢性牙周炎進展中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級6周齡雄性SD大鼠12只，體質量200～250 g，分籠飼養，自由攝食飲水，適應性喂養1周。室溫保持在22～24 ℃，濕度50% ～ 60%，每12 h 變換晝夜節律，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1. 2 材料腺病毒(上海漢恒生物科技有限公司)；rTSP-1(美國R&D公司)；牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(美國invivogen公司)；兔抗vimentin、兔抗keratin、兔抗TSP-1、兔抗COX-2抗體(美國abcam公司)；鼠抗β-actin抗體(武漢三鷹公司)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG抗體(北京中杉金橋公司)；qRT-PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；人IL-6 ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)。體式顯微鏡(德國Leica公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Agilent公司)；化學發光成像儀(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.3 方法

1.3.1實驗性大鼠牙周炎模型建立 隨機取6只大鼠為正常組，剩余6只大鼠以10%的水合氯醛按3 ml/kg體質量腹腔注射麻醉。使用3-0絲線結扎雙側上下頜第一磨牙頸部1圈，結扎絲盡量靠近齦緣，于舌腭側打結。正常組不做處理。成功結扎4周后，所有大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛處死，取雙側上下頜組織(牙齦、牙槽骨、牙齒)。

1.3.2骨喪失量測量 將大鼠上下頜骨置于1 mol/L的NaOH溶液中去除軟組織。用10 g/L的甲苯胺藍染色，體式顯微鏡下觀察并測量骨喪失(alveolar bone loss，ABL)情況，即測量釉牙骨質界到牙槽嵴頂的距離。每個實驗牙分別測量頰、腭(舌)側的近、中、遠6個位點，取6個位點的均值作為實驗牙的ABL值。

1.3.3hPDLFs的分離培養 實驗所涉及的牙經安徽醫科大學倫理委員會同意。取12～18歲因正畸減數拔除的健康前磨牙，在無菌環境下PBS緩沖液及DMEM培養基各沖洗3次，運用組織塊法刮取根中1/3部位的牙周膜組織，剪成1 mm3的組織塊，置于含20%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養基中，37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養，2 d換液1次，待組織塊游出的細胞長至80%時，胰酶消化并傳代。取狀態較好的3～8代的細胞用于后續實驗。

1.3.4hPDLFs的免疫組化鑒定 取第3代hPDLFs培養于鋪有蓋玻片的6孔板中，待細胞長滿蓋玻片70%時，取出蓋玻片，采用免疫組化法進行角蛋白和波形絲蛋白染色，光鏡下觀察染色結果。

1.3.5P.gingivalisLPS(10 μg/ml)誘導hPDLFs 將hPDLFs以1×105/ml的密度鋪至6孔板中，分為2組:① 空白對照組；②P.gingivalisLPS組。

1.3.6攜帶TSP-1基因的重組腺病毒(Ad-TSP-1-GFP)體外轉染hPDLFs Ad-TSP-1-GFP在感染復數(multiplicity of infection, MOI)值為50、100、150及200分別感染細胞48 h，置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，確定最佳MOI值，并以此用于后續實驗。將hPDLFs以1×105/ml的密度鋪至6孔板中，驗證過表達結果時，同時用空白對照和陰性對照，分為3組：① 空白對照組；② Ad-GFP組；③ Ad-TSP-1-GFP組。分析Ad-TSP-1-GFP對hPDLFs炎癥相關細胞因子IL-6、COX-2表達影響時分組如下：① Ad-GFP組；② Ad-GFP+P.gingivalisLPS組；③ Ad-TSP-1-GFP組。

1.3.7rTSP-1體外刺激hPDLFs 將hPDLFs以1×105/ml的密度鋪至6孔板中，分為3組：① 空白對照組；②P.gingivalisLPS組；③ rTSP-1組。研究rTSP-1(1 μg/ml)對hPDLFs炎癥相關細胞因子IL-6、COX-2表達的影響。

1.3.8qRT-PCR檢測mRNA水平 使用TRIzol試劑提取細胞、組織總RNA，測定總RNA的濃度以及純度。以總RNA為模板逆轉錄成cDNA；qRT-PCR 采用SYBR-Green法，β-actin作為校正內參，2-△△Ct法分析基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 β-actin、TSP-1、IL-6、COX-2基因RT-PCR引物序列

1.3.9ELISA檢測細胞培養上清液中IL-6水平 取出-80 ℃保存的細胞培養上清液, 1 000 r/min離心5 min, 取上清液, 應用ELISA技術檢測IL-6水平, 操作步驟按照試劑盒說明書。

1.3.10Western blot檢測蛋白水平 將處理后的組織、細胞置于冰上裂解，提取總蛋白。取20 μg蛋白樣品上樣，經電泳、轉膜、牛奶封閉，加一抗TSP-1(1 ∶1 000)、COX-2(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育90 min，ECL發光顯影。用ImageJ圖像處理軟件分析各條帶灰度值，計算相對表達量。

2 結果

2.1 大鼠實驗牙ABL檢測大鼠牙槽骨實驗牙經甲苯胺藍染色后，體式顯微鏡下拍照，見正常組未見明顯骨吸收，牙周炎組骨吸收達根分叉處(圖1A、B)，測量后的骨喪失量經統計學分析，結果顯示，與正常組比較，牙周炎組骨喪失量增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1C。

圖1 體式顯微鏡觀察測量牙槽骨骨喪失量 ×20

A：正常組；B：牙周炎組；C：2組牙槽骨喪失量；與正常組比較：***P<0.001

2.2 大鼠牙齦組織中TSP-1、IL-6、COX-2的表達Western blot檢測大鼠牙齦組織中TSP-1蛋白表達，結果顯示：與正常組比較，牙周炎組TSP-1蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2A。 qRT-PCR檢測大鼠牙齦組織中TSP-1、IL-6、COX-2 mRNA的表達，結果顯示：與正常組比較，牙周炎組TSP-1、COX-2、IL-6 mRNA表達均不同程度升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2B。

2.3 hPDLFs的免疫組化鑒定采用組織塊法原代培養hPDLFs，可見多數細胞呈梭形放射狀排列，少數細胞為多角形或小圓形。免疫組化檢測顯示，波形絲蛋白染色，胞質著色呈棕黃色，結果呈陽性(圖3A)；角蛋白染色，胞質不著色，結果呈陰性，證實細胞源自中胚層(圖3B)。

圖2 大鼠牙齦組織TSP-1、IL-6、COX-2表達變化

A：Western blot法檢測TSP-1相對表達量；B：qRT-PCR法檢測TSP-1、IL-6、COX-2 mRNA相對表達量；與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3 hPDLFs免疫組化 ×100

2.4P.gingivalisLPS促進hPDLFs TSP-1表達Western blot和qRT-PCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，P.gingivalisLPS (10 μg/ml)可促進TSP-1蛋白和mRNA表達，差異有統計學意義 (P<0.05)。見圖4。

圖4 P. gingivalis LPS促進hPDLFs TSP-1表達

A：Western blot法檢測TSP-1相對表達量；B：qRT-PCR法檢測TSP-1 mRNA相對表達量；1. 空白對照組；2.P.gingivalisLPS組；與空白對照組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.5 細胞轉染效率以不同MOI值的Ad-TSP-1-GFP轉染hPDLFs，轉染48 h后觀察GFP表達情況。當MOI為50時，開始出現綠色熒光，熒光強度比較弱，陽性細胞較少。隨著 MOI 的增加，熒光強度逐漸增強，陽性細胞逐漸增多。當MOI>150 時，繼續增加MOI，但熒光強度的增強不明顯(圖5)，陽性細胞比例基本達到高峰，因此后續實驗均采用MOI值為150。

圖5 Ad-TSP-1-GFP 轉染 hPDLFs熒光觀察 ×200

A：MOI= 50；B：MOI=100；C：MOI=150；D：MOI=200

2.6 Ad-TSP-1-GFP 轉染hPDLFs的效果Western blot和qRT-PCR檢測結果顯示，與Ad-GFP組比較，轉染Ad-TSP-1-GFP可提高TSP-1蛋白和 mRNA的表達水平，差異有統計學意義(F蛋白=24.14,FmRNA=550.5,P<0.05)。見圖6。

圖6 Ad-TSP-1-GFP轉染 hPDLFs TSP-1 的表達變化

A：Western blot法檢測TSP-1相對表達量；B：qRT-PCR法檢測TSP-1 mRNA相對表達量；1：空白對照組；2：Ad-GFP組；3：Ad-TSP-1-GFP組；與Ad-GFP組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.7 TSP-1促進hPDLFs IL-6的表達轉染Ad-TSP-1-GFP 48 h，收集細胞培養上清液，ELISA檢測IL-6蛋白含量，結果顯示：與Ad-GFP組比較，轉染Ad-TSP-1-GFP可提高細胞IL-6蛋白表達水平，差異有統計學意義(F=28.41，P<0.01，圖7A)；qRT-PCR檢測結果顯示：與Ad-GFP組比較，轉染Ad-TSP-1-GFP可促進IL-6 mRNA 的表達(F=85.29，P<0.001，圖7B)。在細胞培養中添加rTSP-1，收集細胞培養上清液，ELISA法檢測IL-6含量，結果顯示：與空白對照組比較，rTSP-1可活化細胞，上調其IL-6蛋白表達，差異均有統計學意義(F=36.19，P<0.01，圖8A)；qRT-PCR的結果顯示rTSP-1可促進IL-6 mRNA的表達，與空白對照組比較，差異有統計學意義(F=30.67，P<0.001，圖8B)。

2.8 TSP-1促進hPDLFs COX-2的表達轉染Ad-TSP-1-GFP 48 h，分別收集細胞提取總蛋白和總RNA。Western blot檢測hPDLFs COX-2蛋白相對表達量，結果顯示：與Ad-GFP組比較，轉染Ad-TSP-1-GFP可明顯增高COX-2蛋白表達，差異有統計學意義(F=4.508，P<0.05，圖9A)；qRT-PCR檢測結果顯示：與Ad-GFP組比較，轉染Ad-TSP-1-GFP可促進COX-2 mRNA相對表達量(F=42.69，P<0.001，圖9B)。在細胞培養中添加rTSP-1，分別收集細胞提取總蛋白和總RNA。Western blot檢測hPDLFs COX-2蛋白相對表達量，結果顯示：與空白對照組比較，rTSP-1可活化細胞上調其COX-2蛋白相對表達量，差異均有統計學意義(F=9.954，P<0.05，圖10A)；qRT-PCR的結果顯示：rTSP-1可促進COX-2 mRNA相對表達量，與空白對照組比較，差異有統計學意義(F=34.73，P<0.01，圖10B)。

A：ELISA法檢測IL-6含量；B：qRT-PCR法檢測IL-6 mRNA相對表達量；1：Ad-GFP組；2：Ad-GFP+P.gingivalisLPS組；3：Ad-TSP-1-GFP組；與Ad-GFP組比較：**P<0.01，***P<0.001

A：ELISA法檢測IL-6含量；B：qRT-PCR法檢測IL-6 mRNA相對表達量；1：空白對照組；2：P.gingivalisLPS組；3：rTSP-1組；與空白對照組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖9 Ad-TSP-1-GFP對hPDLFs COX-2表達的影響

A：Western blot法檢測COX-2相對表達量；B：qRT-PCR法檢測COX-2 mRNA相對表達量；1：Ad-GFP組；2：Ad-GFP+P.gingivalisLPS組；3：Ad-TSP-1-GFP組；與Ad-GFP組比較：*P<0.05，***P<0.001

3 討論

慢性牙周炎的發生涉及一系列免疫炎癥反應，微生物等通過活化組織細胞，釋放細胞因子，如IL-6、COX-2等，加劇炎癥應答[6-7]。IL-6可促進血管生成，趨化炎癥細胞，且能延緩巨噬細胞的吞噬作用，加重局部炎癥反應。COX-2經刺激迅速產生，作為高度可誘導性的COX，可催化花生四烯酸轉化為前列腺素，參與炎癥反應，加劇組織破壞。

圖10 rTSP-1對hPDLFs COX-2表達的影響

A：Western blot法檢測COX-2相對表達量；B：qRT-PCR法檢測COX-2 mRNA相對表達量；1：空白對照組；2：P.gingivalisLPS組；3：rTSP-1組；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

正常生理狀態下TSP-1表達水平很低，可限制人巨噬細胞產生IL-1β，具有一定的免疫自穩的作用。當組織細胞受到外源性刺激活化，可大量分泌TSP-1，在病理情況下發揮重要作用，從而參與真菌、細菌等微生物感染性疾病和關節炎、肺纖維化等炎癥免疫性疾病進展[8]。研究[4]發現，慢性牙周炎齦下菌斑中的P.gingivalisLPS亦可引起人單核細胞TSP-1的表達，IL-17能夠顯著促進這一蛋白的表達。本課題組的前期研究[9]也證實活化的人巨噬細胞可高表達TSP-1，繼而通過NF-κB信號通路調節炎性細胞因子的分泌水平。

本研究構建大鼠牙周炎模型，采集炎癥牙齦組織，檢測IL-6、COX-2表達，顯示局部組織中IL-6、COX-2 mRNA表達升高，同時TSP-1蛋白和mRNA表達水平亦升高。hPDLFs是牙周膜中數目最多，功能最重要的細胞，不僅作為機械屏障參與防御，同時具有免疫調節作用。本研究體外實驗中，分離培養hPDLFs，用P.gingivalisLPS誘導活化細胞，TSP-1蛋白和mRNA表達水平均上調。結果表明，除了單核巨噬細胞之外，活化的hPDLFs也是TSP-1的重要來源。

之后，本研究構建過表達TSP-1質粒的重組腺病毒，通過基因轉染技術上調hPDLFs自身TSP-1表達水平，結果顯示TSP-1基因轉染使hPDLFs在蛋白和mRNA水平均表現出TSP-1表達上調。同時，細胞過表達TSP-1后，可促進IL-6蛋白和mRNA的表達，這與重組小鼠TSP-1蛋白促進平滑肌細胞IL-6分泌的相關研究[10]一致。有研究[11]指出在紫外線輻射導致的皮膚癌中，TSP-1通過抑制COX-2改善紫外線對皮膚的損傷。然而在本研究中，增加 hPDLFs自身TSP-1的表達，可促進IL-6和COX-2蛋白和mRNA表達。隨后，本研究直接在細胞培養中添加rTSP-1，刺激細胞24 h后，IL-6、COX-2蛋白和mRNA水平均升高，提示外源性的TSP-1亦可正向調控細胞IL-6和COX-2的表達，且TSP-1對于IL-6和COX-2的誘導作用與P.gingivalisLPS類似。

綜上所述，慢性牙周炎疾病進程中，感染細菌作為始動因子活化hPDLFs，使其高表達TSP-1，TSP-1繼而作為炎性介質，進一步促進hPDLFs牙周炎相關細胞因子的釋放。在宿主對細菌的應答作用中，TSP-1的參與使得局部組織隨著疾病進展進一步崩解破壞。但目前TSP-1通過何種途徑調節炎性因子的表達，以及在動物模型中下調TSP-1的表達能否改善牙周局部組織破壞情況，尚需系統的實驗研究來進一步的探索。