miR-21在抗結核藥物性肝損傷細胞中的機制研究

徐 杰，杜 瑩，馬 玉，賈云鵬，吳冬雪，張 咪，王 雪，朱晗瑀，馮福民,2

抗結核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury , ADLI)是異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等常用的一線抗結核藥物在抗結核治療過程中產(chǎn)生的最嚴重也是最受臨床關注的副作用[1]。目前，在全球范圍內(nèi)抗結核藥物引起的ADLI占結核病患者的0.8%～40.0%，并且這種不良用藥反應已經(jīng)成為臨床停止抗結核用藥的重要原因之一[2]，已有研究[3]表明肝損傷發(fā)生時，藥物在體內(nèi)多種藥物代謝酶(尤其肝藥酶)的作用下引起的炎癥反應起著重要作用。核轉錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信號通路是參與炎癥反應的重要信號通路之一，受到某些條件刺激后，NF-κB信號通路被激活，可以調(diào)控下游炎癥因子的轉錄水平，主要炎癥因子為白細胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等[4-5]。

miR-21是一個具有炎性作用且在多種疾病中呈高表達的多功能miRNA分子[6]。現(xiàn)使用抗結核藥物刺激人正常肝細胞(human normal liver cells, HL-7702)，觀察抗結核藥物致肝細胞損傷過程中miR-21與NF-κB的表達變化，并且通過敲減和過表達miR-21進一步檢測NF-κB信號通路調(diào)控的下游炎癥因子的表達水平與變化情況，深入驗證在ADLI發(fā)生發(fā)展中miR-21的作用機制，從而進一步為miR-21在抗結核藥物性肝損傷中的作用提供新的認識。

1 材料與方法

1.1 材料人正常肝細胞株HL-7702 購自上海中科院細胞所；RPMI 1640 購自美國Corning cellgro公司; 胎牛血清購自美國CLARK公司；異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、二甲基亞砜均購自日本東京化成工業(yè)株式會社；青霉素與鏈霉素均購自德國BI公司；0.25%胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；miR-21 mimics、inhibitor均由蘇州吉瑪基因公司合成；NF-κB抗體購自臺灣arigo公司；高效RIPA細胞快速裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司； SDS-PAGE新快速凝膠制備試劑盒、20×TBST洗滌緩沖液均購自北京莊盟國際生物科技有限公司；PVDF膜(0.45 μm)購自美國MilliPore公司；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Invitrogen公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自美國abcam公司；PrimeScriPtTM RT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM II PCR試劑盒均購自大連TaKaRa公司；丙氨酸氨基轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所； Human IL-6 、TNF-α ELISA試劑盒均購自北京冬歌偉業(yè)生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組HL-7702為梭形且貼壁生長的細胞，適合生長于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。將其復蘇后快速接種于50 ml的細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入提前配置好的細胞培養(yǎng)液6 ml。每天定時用光學顯微鏡對HL-7702細胞的生長狀態(tài)以及污染情況進行觀察，如HL-7702細胞生長正常且無污染，則每天進行細胞換液1次；當細胞密度為80%左右進行細胞傳代。

細胞分組情況：空白對照組(control組)、異煙肼+利福平+吡嗪酰胺三藥聯(lián)合組(藥物組)、藥物+miR-21敲減組(藥物+miR-21 inhibitor組)、藥物+miR-21 過表達組(藥物+miR-21 mimics組)、敲減陰性對照組(inhibitor 陰性對照組)、過表達陰性對照組(mimics 陰性對照組)。

1.3 siRNA轉染貼壁細胞進行轉染時，細胞生長密度太高或者細胞傳代次數(shù)太多都會對其轉染效果產(chǎn)生一定的影響，當生長密度在60%～80%之間且細胞處于對數(shù)生長期時細胞轉染效果是最佳的。所以，在HL-7702細胞接種于6孔板時，每孔需要加入2 ml提前配置好的細胞培養(yǎng)液使其密度在1×105～2×105個/ml之間。制備轉染復合物，在靜置轉染復合物間隙，進行細胞換液，細胞培養(yǎng)液需提前30 min從4 ℃拿出預熱，6孔板中每孔加入2 ml。將靜置好的細胞轉染復合物加入各孔，輕輕晃動混勻，在細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。12 h后進行細胞換液，將2 ml提前預熱的1640細胞培養(yǎng)液加入control組，其他各實驗組加入2 ml含800 μg/ml藥物的1640培養(yǎng)液，放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后收集每孔細胞及上清液，進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞形態(tài)學觀察及肝功指標檢測采用HE染色法觀測細胞形態(tài)。根據(jù)ALT、AST肝功檢測試劑盒中的說明測定各組細胞上清液中的肝功指標。

1.5 肝細胞miR-21、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表達檢測收集細胞，總RNA提取采用TRIzol法，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進行反轉錄，qRT-PCR使用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s共40個循環(huán)。引物的設計及合成均來自生工生物工程(上海)股份有限公司。miR-21表達水平的檢測以U6作為內(nèi)參，NF-κB、TNF-α、IL-6表達水平的檢測用GAPDH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt計算mRNA表達水平。見表1。

表1 引物序列

1.6 肝細胞NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白含量檢測NF-κB蛋白檢測采用Western blot法；ELISA法檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-6的蛋白含量。

2 結果

2.1 各組細胞形態(tài)學變化對照組HL-7702細胞形態(tài)為梭形或多邊形的正常貼壁細胞，胞質(zhì)呈飽滿狀態(tài)；藥物組肝細胞形態(tài)為扁圓且細胞數(shù)量較少，胞質(zhì)呈皺縮狀態(tài)。而miR-21過表達組細胞進一步減少，miR-21敲減組細胞損傷情況較藥物組略輕。見圖1。

2.2 各組細胞上清液中ALT和AST的含量比較與control組相比，各組細胞上清液中ALT、AST含量增加(t=-156.227、-129.715，均P<0.001)，表明藥物組肝細胞發(fā)生損傷；和藥物組比較，藥物+miR-21 inhibitor組的ALT、AST含量降低(t=-42.325、-50.524，均P<0.001)，藥物+miR-21 mimics組則進一步升高(t=-219.504、-180.454，均P<0.001)，表明敲減和過表達miR-21可以分別引起抗結核藥物性肝損傷的減輕與加重。miR-21 mimics陰性對照組和inhibitor 陰性對照組則與control組差異均無統(tǒng)計學意義(mimics 陰性對照組t=0.391、-0.742，P=0.716、0.521；inhibitor 陰性對照組t=-0.386、0.631，P=0.719、0.562)，尚不能認為mimics和inhibitor對所培養(yǎng)的人肝細胞有毒副作用。見表2。

2.3 各組細胞miR-21和NF-κB、 TNF-α、IL-6的mRNA相對表達量比較與control組比較，藥物組miR-21 mRNA相對表達量增高(t=-23.349，P<0.001)，提示miR-21參與到了抗結核藥物致肝細胞損傷過程中；與control組比較，藥物組NF-κB、TNF-α、IL-6 的mRNA表達均增高(t=-67.352、-78.207、-63.725，均P<0.001)，表明藥物組細胞出現(xiàn)了炎癥性損傷；與control組比較，mimics 陰性對照組和inhibitor陰性對照組miR-21及NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義(mimics陰性對照組t=61.446、80.230、63.218、26.437，均P>0.05；inhibitor陰性對照組t=71.068、66.989、59.697、37.631，均P>0.05)，尚不能認為siRNA對各指標mRNA表達有影響；藥物+miR-21 mimics組NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA及miR-21相對表達量進一步增高(t=27.364、-18.693、-44.970、-12.176，均P<0.001)，而藥物+miR-21 inhibitor組NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA及miR-21表達下降(t=53.442、46.629、46.342、7.201，P<0.001、<0.001、<0.001、0.002)，提示過表達miR-21會通過增加NF-κB的表達，進而使炎癥因子表達增加從而加重細胞炎癥損傷的發(fā)生，敲減miR-21可以通過降低NF- κB的表達，進而減少炎癥因子表達從而減輕抗結核藥物引起的炎癥反應。見表3。

圖1 各組細胞HE染色光鏡圖 ×100

A：control組；B：藥物組；C：藥物+miR-21 mimics組；D：mimics陰性對照組：E：藥物+miR-21 inhibitor組；F：inhibitor 陰性對照組

表2 各組細胞上清液中ALT、AST含量

與control組比較：***P<0.001；與藥物組比較：△△△P<0.001

2.4 各組NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達比較相同的，抗結核藥物刺激造成HL-7702細胞NF-κB 、TNF- α、IL-6的蛋白表達也升高(t=-46.317、-25.200、-14.105，均P<0.001)，表明藥物組細胞發(fā)生了炎癥反應。轉染miR-21后，各指標蛋白與對應mRNA的變化趨勢相符，提示過表達和敲減miR-21可能影響抗結核藥物致肝細胞損傷中炎癥反應的發(fā)生(與藥物組比較，藥物+miR-21 inhibitor組t=15.057、-8.755、-4.394，P<0.001、0.001、0.012；藥物+miR-21mimics組t=-5.890、7.313、4.385，P=0.004、0.002、0.012)。見表4。

表3 各組細胞miR-21及NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達量

與control組比較：***P<0.001；與藥物組比較：△P<0.05

表4 各組細胞NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達量比較

與control組比較：***P<0.001；與藥物組比較：△P<0.05

3 討論

miRNA能夠轉錄后調(diào)控基因的表達，影響幾乎所有的信號通路，參與多種生理病理進程，包括炎癥反應、細胞增殖，侵襲和凋亡。許多研究[7]表明，miRNA的異常表達可能反映細胞的病理狀態(tài)。其中miR-21是一個可以在多種疾病中調(diào)控炎癥因子的發(fā)生發(fā)展且具有炎癥作用的多功能miRNA分子，并且在各種人類腫瘤中，miR-21是最常上調(diào)的miRNA之一，包括非小細胞肺癌、胃癌等[8-9]。同時，研究[10]證明miR-21的過表達是非小細胞肺癌的獨立預后因素，miR-21也會在骨質(zhì)疏松個體中顯著過表達。

miR-21基因啟動子區(qū)中包含4種NF-κB的反應結合元件，在前列腺癌細胞中，干擾素誘導的miR-21表達時需要NF-κB識別miR-21的啟動子序列然后與其結合[11]；在非小細胞肺癌、人乳腺癌和直腸HCT116腫瘤細胞系中的研究也表明NF-κB可以識別miR-21的啟動子序列，從而激活miR-21調(diào)控下游反應[8，12]。

NF-κB是細胞對多種生理刺激反應的關鍵介質(zhì)，NF-κB信號通路參與了炎癥的發(fā)生和發(fā)展，在炎癥損傷的誘導中起著關鍵作用[13]，并且NF-κB的高表達與肝臟疾病的發(fā)病密切相關[12]。研究[14]表明，通過靶向NF-κB信號通路，miR-21可負性調(diào)節(jié)脂多糖誘導的急性肺損傷的炎癥反應。研究[1]顯示，在抗結核藥物的作用下，NF-κB對促炎性因子TNF-α的表達具有正向調(diào)控作用，使TNF-α過量產(chǎn)生。此次結果也顯示，ADLI中炎癥因子TNF-α、IL-6隨NF-κB表達升高而升高，進一步提示肝損傷發(fā)生過程中藥物在體內(nèi)多種藥物代謝酶(尤其肝藥酶)的作用下可引起的炎癥反應且起著重要作用。

本實驗研究結果顯示，抗結核藥物刺激肝細胞時，miR-21和NF-κB表達均呈升高趨勢，并且在過表達miR-21與敲減miR-21兩種作用下，NF-κB表達水平分別呈升高與降低趨勢，進而影響下游炎癥因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，TNF-α、IL-6的表達變化與miR-21和NF-κB趨勢一致，這表明miR-21通過作用于NF-κB信號通路來調(diào)控ADLI中的炎癥反應的發(fā)生，其機制可能是NF-κB通過識別miR-21啟動子區(qū)并與其結合從而使miR-21被激活，同時miR-21的促炎效應可通過正反饋形式來激活NF-κB信號通路進而影響下游炎癥因子來發(fā)揮。

miR-21可降低NF-κB的活性而減輕抗結核藥物引起的肝細胞損傷。但實驗只在一種細胞系HL-7702中進行了驗證，未考慮細胞系的多樣性，仍需進行其他人正常細胞系的實驗驗證，同時也需要進行更深層次機制研究來明確兩者的作用機制，為抗結核藥物性肝損傷的防治提供更完善的依據(jù)。