PLA2R1基因單核苷酸多態性與IMN的相關性研究

謝大星，郭廣鳳，張雪琴，姜 鴻，陸 晨

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是成人腎病綜合征最常見的病理類型之一，根據有無繼發因素分為特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)和繼發性膜性腎病(secondary membranous nephropathy，SMN)。約1/3的MN患者在5～10年內進展至終末期腎臟病，需要腎臟替代治療，給患者及家庭帶來沉重的負擔，IMN的發病機制目前尚不明確，近年來全基因組關聯分析研究[1]檢測到M型磷脂酶A2受體1(phospholipase A2 receptor 1， PLA2R1)和人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DQA1區是MN的主要風險位點，國內不同[2-3]地區陸續發表了檢測MN易感基因位點的文獻，地域差異相同的基因位點對IMN的易感性也存在差異，新疆處于中國的西北部，關于MN基因多態性研究的文獻較少。該研究主要分析新疆地區人群PLA2R1基因2位點與IMN易感性的關聯性。

1 材料與方法

1.1 病例資料以2010年1月～2018年12月在新疆維吾爾自治區人民醫院確診的88例IMN和122例種族匹配的在新疆維吾爾自治區人民醫院體檢中心健康體檢者為研究對象。IMN組中男66例，女22例，年齡19～76(48.00±13.97)歲；健康對照組中男88例，女34例，平均年齡21～78(42.83±12.62)歲。病例組納入標準：① 所有患者均行腎活檢，病理檢查包括光鏡、免疫熒光/免疫組化和電鏡；② 診斷標準符合Ehrenreich-Churg膜性腎病診斷標準[4]。排除SMN。所有患者均簽署知情同意書，本研究方案經新疆自治區人民醫院醫學倫理委員會審查通過。收集納入研究對象腎穿或體檢完善的臨床資料，包括：性別、確診年齡、民族、收縮壓、舒張壓 、白蛋白、24 h尿蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸、三酰甘油、總膽固醇、PLA2R抗體等指標。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 收集研究對象清晨空腹靜脈血5 ml,EDTA抗凝，-80 ℃冰箱保存，標本收集完成后按照DNA試劑盒(北京鼎國公司)實驗步驟提取DNA，采用紫外分光光度計測定260 nm/280 nm波長的吸光度，使純度在1.80以上，將分裝好的DNA放-80 ℃冰箱保存，最后送新疆歐易公司進行競爭性等位基因特異性聚合酶鏈式反應(kompetitive allele specific polymerase chain reaction,KASP)法單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點基因分型。

1.2.2PCR擴增及基因分型 將DNA濃度稀釋成為10～20 ng/μl，并將DNA樣品加到384孔PCR板上，然后配制KASP反應體系，將KASP反應體系加到已含DNA模板的PCR板上，將反應板密封后離心，進行PCR循環反應，最后在Pherastar SNP分型儀進行數據讀取和分析。KASP反應體系：反應體系5 μl:包含 2×Master mix 2.5 μl、引物預混液 0.05 μl、 DNA模板 1.0 μl 和ddH2O 1.45 μl,KASP反應程序：預變性94 ℃ 15 min，1個循環，變性94 ℃ 20 min，10個循環，復性/延伸61～55 ℃，60 min(每一個循環降低0.6 ℃)，10個循環，變性94 ℃ 20 min，26個循環，復性/延伸55 ℃ 60 min，26個循環。

2 結果

2.1 病例資料兩組間性別和民族差異無統計學意義(P>0.05)。IMN組中年齡、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇水平高于健康對照組，白蛋白水平低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 哈迪-溫伯格平衡定律檢驗及KASP分型圖對2個位點病例組及健康對照組進行檢驗，其中rs4664308位點在病例組和健康對照組中均不符合哈迪-溫伯格平衡定律，rs3749117位點病例組和健康對照組基因型數目的觀察值處于哈迪-溫伯格平衡狀態(P>0.05)，具有群體代表性。rs3749117位點KASP分型圖。見圖1。

2.3 不同基因型在IMN組和健康對照組間的分布通過χ2檢驗比較IMN組和健康對照組間基因型及等位基因的分布，結果顯示rs3749117位點基因型及等位基因在病例組和健康對照組間分布差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 IMN和健康對照組臨床資料比較

圖1 rs3749117位點KASP分型圖

表2 IMN組和健康對照組PLA2R1基因rs3749117位點基因型分布表[n(%)]

2.4 PLA2R1基因rs3749117位點基因多態性與IMN臨床指標的關聯性rs3749117位點TT基因型組和CT+CC基因型組組間年齡、性別、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、白蛋白、尿蛋白差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 rs3749117位點TT基因型組與CT+CC基因型組臨床資料比較

2.5 血清抗PLA2R抗體在PLA2R1基因rs3749117位點基因型的表達共有70例在腎活檢時檢測血PLA2R抗體，男52例，女18例，年齡19～76(47.57±13.79)歲。結果顯示rs3749117位點TT基因型組與CT+CC基因型組組間PLA2R抗體陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 rs3749117位點不同基因型PLA2R抗體分布情況[n(%)]

2.6 IMN的影響因素分析以是否診斷IMN為因變量，性別、年齡、rs3749117位點TT基因型、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇為自變量進行單因素Logistic二元回歸分析， 結果顯示性別、年齡、rs3749117位點TT基因型、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇均與IMN的發病相關，通過校正性別、年齡、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇等指標進行多因素Logistic回歸分析顯示rs3749117位點TT基因型和年齡可影響IMN的發生(P<0.05)。見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析

2.7 rs3749117位點在不同年齡段與IMN的關聯性分析按年齡進行分組，18～<40歲77例，40～<60歲98例，≥60歲35例，通過χ2檢驗和非參數檢驗顯示病例組和對照組中性別、尿酸、三酰甘油和總膽固醇在不同年齡段間差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。通過分層χ2檢驗顯示在18～<40歲年齡段和40～<60歲年齡段中IMN和健康對照組間基因型分布差異具有統計學意義(P<0.05)，在40～<60歲年齡段攜帶TT基因型的人患IMN的風險高于18～<60歲年齡段(OR1=2.662，95%CI=1.024～6.918;OR2=10.524，95%CI=3.293～28.230)，在≥60歲年齡段中rs3749117位點基因型分布差異無統計學意義(P>0.05)。見表7。

表6 不同年齡段中尿酸、三酰甘油和總膽固醇水平比較

表7 rs3749117位點在不同年齡段與IMN的關聯性分析

3 討論

2009年Beck et al[5]在IMN患者血清中發現了PLA2R抗體，PLA2R主要表達于腎小球足細胞，是IMN主要的靶抗原，國內血清中抗PLA2R抗體陽性率約為70%～80%，近年來國內外多地區發現PLA2R1基因SNP位點與IMN的易感性相關[2-3，6-7]，種族及地域差異會影響基因位點對IMN的易感性。本研究采用KASP的方法進行測序結果顯示PLA2R1 SNP rs3749117位點基因型及等位基因頻率在IMN組和健康對照組間分布差異有統計學意義，提示rs3749117位點多態性可能與IMN的易感性相關。rs3749117位點位于5號外顯子區域，2號染色體上，在IMN組中rs3749117位點TT基因型和T等位基因頻率較高，提示TT基因型為IMN的易感基因型，T等位基因為易感等位基因，這與日本學者Kaga et al[7]及北京地區Lv et al[3]的研究結果一致，與印度地區研究[6]結果存在差異。

在健康人群中也有一部分人攜帶IMN的易感基因型，但并未發病，提示IMN的發病并非單因素，可能是多因素共同作用。Xu et al研究[8]顯示在IMN中PM高于70 μg/m3的區域中，PM濃度每增加10 μg/m3，pMN的概率就會增加14%，提示環境和基因多態性可影響IMN的發生。通過分析rs3749117位點基因型與IMN臨床表現顯示基因多態性并不能影響IMN的臨床表現。血清抗PLA2R抗體滴度是臨床上重要的生物指標，抗體滴度與臨床表現相關，還可評估免疫緩解，本研究分析顯示rs3749117位點易感基因型組與非易感基因型組中PLA2R抗體陽性率差異無統計學意義，提示PLA2R1基因多態性并不能影響血清PLA2R抗體的表達，印度學者Ramachandran et al研究[6]發現HLA-DQA1 rs2187668位點高風險GG基因型患者血清PLA2R抗體水平較高,Wang et al[9]研究也顯示HLA-DRB1*0301與更高水平的PLA2R抗體相關,提示HLA基因多態性位點可影響血清抗PLA2R抗體的水平，機制尚有待進一步研究。通過多因素Logistic回歸分析顯示年齡可影響IMN的發生，當年齡每增加一個單位，患IMN的風險增加1.037倍。本研究進行分層χ2檢驗顯示在18～<40年齡段和40～<60年齡段中基因型分布差異有統計學意義，在18～<40和40～<60歲年齡段中TT基因型為易感基因型，且攜帶TT基因型較攜帶CT+CC基因的患病風險高(OR1=2.662，95%CI=1.024～6.918;OR2=10.524，95%CI=3.293～28.230)，MN病初次發病年齡以40歲以上多見，本研究結果也提示在40～<60歲年齡段中攜帶TT基因型的患病風險高于18～<40歲年齡段，而在≥60歲年齡段中rs3749117位點基因型在IMN和健康對照間分布差異無統計學意義，提示rs3749117位點的基因多態性可能與老年IMN的發生無關。隨著年齡的增長，人體的各個系統和器官逐漸老化，腎臟的各種功能進行性下降，老年人容易合并高血壓、糖尿病和腫瘤等基礎疾病，可能存在其他基因位點或因素影響老年人患MN的風險，目前尚無研究報道老年MN病的易感基因位點，彭佳楠等的研究[2]同樣也表明年齡可影響IMN的發生，但并未進一步探討，本次研究中rs3749117位點的基因多態性并不能影響老年人對IMN的易感性，機制尚不明確，有待進一步研究。

本研究結果顯示新疆地區rs3749117位點可能與IMN的易感性相關，在18～<40歲和40～<60歲年齡段中基因型TT為IMN的易感基因型,但老年人(≥60歲)中rs3749117位點的基因多態性可能與老年IMN的發生無關，其次rs3749117位點多態性不能影響臨床表現,本次研究為尋找防治IMN 的基因靶點和探討MN病的發病機制提供一定的理論依據。