性別對咪喹莫特誘導小鼠銀屑病模型建立的影響

羅婷婷，韓陳陳，崔東倩，張 雨，劉 倩，馬 旸，魏 偉

銀屑病是一種自身免疫性疾病，影響全球約1.25億人口[1]，主要表現為紅色斑塊上有白色鱗屑。銀屑病發病機制極其復雜，涉及遺傳、炎癥、免疫等多個方面，目前尚未完全明確[2-3]。建立理想的動物模型可以為發病機制的探究提供基礎和保障，其中咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導的小鼠銀屑病模型運用廣泛且操作簡便。性激素能夠通過多種方式對免疫系統產生影響，因此在一些與自身免疫疾病有關的動物模型中性別差異會對模型的建立產生一定的影響，如類風濕關節炎模型[4]。銀屑病作為一種自身免疫性疾病，其模型的建立是否也會受到性別差異的影響，為了探究這一問題，現通過建立不同性別的IMQ誘導的小鼠銀屑病模型，對模型進行評價并探究性別差異對IMQ誘導小鼠銀屑病模型建立的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡BALB/c小鼠，30只，體質量20～22 g，雌雄各半，清潔級環境飼養。由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器IMQ乳膏(珠海聯邦制藥中山分公司)；凡士林乳膏(天津博迪公司)；脫毛膏(上海保健品九店公司)；乙二胺四乙酸(ethylenediami-netetraacetic acid,EDTA)抗原修復液、Triton X-100和DAPI(上海碧云天公司)；H2O2(北京中衫金橋)；增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和內披蛋白一抗(美國 Santa Cruz Biotechnology公司)；594山羊抗鼠IgG(H+L) 美國(Jackson Immuno Research公司)；儀器Olympus顯微成像系統(日本Olympus)；RM 2135石蠟切片機、激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1分組與模型建立 30只BALB/c小鼠隨機均分為正常對照組、模型組1(雄性)、模型組2(雌性)。使用脫毛膏將小鼠背部(2 cm×3 cm)毛發完全脫去，稱取IMQ乳膏62.5 mg均勻涂抹于模型組小鼠背部，對照組小鼠涂抹等量的凡士林乳膏，每天涂抹1次，一共持續5 d。

1.3.2小鼠背部皮損變化觀察 采用銀屑病皮損面積和嚴重程度( psoriasis area and severity index,PASI) 對皮損進行評分[5]，用數碼相機每天拍照記錄皮損變化情況，給予小鼠皮損處紅斑、鱗屑、增厚程度0～4的評分，將3者評分相加得到總分。PASI 評分標準如下：無=0分；輕度=1分；中度=2分；重度=3分；極重度=4分；總分=鱗屑+增厚+紅斑(0～12分)。

1.3.3取材與處理 第6天上午造模結束采用頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺、背部皮膚，取三分之一皮膚置于4%的多聚甲醛中常溫保存，其余組織均放置-80 ℃保存。

1.3.4小鼠脾臟指數與胸腺指數計算 脾臟指數=小鼠脾臟質量(mg)/小鼠體質量(g)，胸腺指數=小鼠胸腺質量(mg)/小鼠體質量(g)。

1.3.5小鼠皮膚組織病理學觀察與表皮厚度的檢測 將放置于4%多聚甲醛中的皮膚組織經脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察小鼠皮膚組織病理改變。選取HE染色切片顯微鏡下觀察拍照，在每張切片中隨機測量3處從表皮角質層到基底層的表皮垂直距離，分析表皮層增厚情況。

1.3.6免疫組化法檢測小鼠皮膚PCNA的表達 將石蠟切片脫蠟水化，封閉，再加抗原修復液進行冷修復，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精進行復染，最后在顯微鏡下觀察每組PCNA的表達情況。

1.3.7免疫熒光法檢測小鼠皮膚內披蛋白的表達 將石蠟切片脫蠟水化，抗原修復液進行冷修復，BSA封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，DAPI染核10 min，加抗熒光淬滅劑，指甲油封片，最后在熒光顯微鏡下觀察每組內披蛋白的表達情況。

2 結果

2.1 小鼠皮膚形態觀察由圖1 A可知對照組小鼠在第1～5天皮膚均細膩光滑。由圖1 B、C可知與對照組小鼠比較，IMQ誘導的小鼠在第1天就表現出輕微鱗屑，皮膚微微泛紅，第2天鱗屑增多涉及整個皮膚表面，并且出現增厚現象，可見較淺的紅斑，第3天鱗屑分布更加密集，增厚現象進一步加重，紅斑顏色也進一步加深，第4、5天皮損現象進一步加重，雄性小鼠和雌性小鼠皮損變化相似。

圖1 IMQ誘導的小鼠第1～5天皮膚形態變化

圖2 IMQ誘導的小鼠第1～5天PASI評分變化

A：增厚；B：鱗屑；C：紅斑；D：總分；與對照組小鼠比較：**P<0.001

圖3 IMQ誘導的小鼠皮膚組織病理學觀察及HE染色中表皮厚度的變化

A：小鼠皮膚組織病理學改變 HE×400；B：HE染色下小鼠表皮厚度；a：對照組；b：模型組1；c：模型組2；與對照組比較：***P<0.001

2.2 小鼠皮膚PASI評分依據PASI評分標準，每天對小鼠進行拍照，評分，根據其均值和方差繪制曲線圖。由圖2 A、B可知IMQ誘導的雄性和雌性小鼠皮膚增厚和鱗屑評分在第1～5天均持續升高，由圖2 C可知IMQ誘導的雄性小鼠皮膚紅斑評分在第2～5天持續升高，雌性小鼠皮膚紅斑評分在第1～5天持續升高。將3者評分相加得到總分，由圖2 D可知，IMQ誘導的雄性和雌性小鼠皮膚總分在第1～5天均持續升高，差異有統計學意義，雄性和雌性小鼠PASI評分變化差異無統計學意義。

2.3 小鼠皮膚組織病理學觀察及HE染色中表皮厚度的變化從圖3 A(a) HE染色中可以看出對照組小鼠皮膚結構正常，表皮層細胞只有兩三層。從圖3 A(b、c)HE染色中可以看出與對照組小鼠比較，IMQ誘導的小鼠表皮增厚、表皮淺層可見毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤、角質層可見角化不全、顆粒層變薄甚至消失、棘層肥厚并有表皮突下延，雄性和雌性小鼠皮膚組織病理學變化相似。選取HE切片400 ×的視野，使用photoshop圖片處理軟件在每個視野中隨機量取3處表皮的垂直距離，取其平均值，分析IMQ誘導的雄性和雌性小鼠表皮增厚情況。由圖3 B可知，與對照組小鼠表皮厚度(12.5±2.3)μm比較，IMQ誘導的雄性小鼠表皮厚度(55.4±1.1)μm(F=4.757，P<0.001)和雌性小鼠表皮厚度(52.3±2.8) μm(F=1.488,P<0.001)均增加，差異有統計學意義。而與IMQ誘導的雄性小鼠表皮厚度比較，IMQ誘導的雌性小鼠表皮厚度增加差異無統計學意義(F=6.805,P>0.05)。

2.4 小鼠脾臟指數和胸腺指數測定由圖4 A可知，與對照組小鼠脾臟指數比較(3.6±0.8)，IMQ誘導的雄性小鼠脾臟指數(10.1±0.9)(F=1.350，P<0.001)和雌性小鼠脾臟指數(9.6±1.0)(F=1.742，P<0.001)均升高，差異有統計學意義。而與IMQ誘導的雄性小鼠脾臟指數比較，IMQ誘導的雌性小鼠脾臟指數變化差異無統計學意義(F=10.2，P>0.05)。由圖4 B可知，與對照組小鼠胸腺指數比較(2.5±0.5)，IMQ誘導的雄性小鼠胸腺指數(2.7±0.3)(F=2.564，P>0.05)和雌性小鼠胸腺指數(2.7±0.4)(F=1.7，P>0.05)變化差異均無統計學意義，與IMQ誘導的雄性小鼠胸腺指數比較，IMQ誘導的雌性小鼠胸腺指數變化差異也無統計學意義(F=10.2，P>0.05)。

圖4 IMQ誘導的小鼠脾臟指數和胸腺指數

A：脾臟指數；B：胸腺指數：a：對照組；b：模型組1；c：模型組2；與對照組比較：***P<0.001

2.5 免疫組化法檢測小鼠皮膚PCNA的表達PCNA為增殖細胞核抗原，可以反映角質形成細胞的增殖程度，由圖5 A (a)可知，對照組小鼠PCNA在表皮基底層呈一層線性排列,由5 A (b、c)可知IMQ誘導的雄性小鼠和雌性小鼠PCNA表達均增多，呈多層排列。由圖5 B可知，與對照組小鼠PCNA陽性細胞表達數量(44.3±4.2)個比較，IMQ誘導的雄性小鼠PCNA陽性細胞表達數量(102.3±5.8)個(F=1.9，P<0.001)和IMQ誘導的雌性小鼠PCNA陽性細胞表達數量(96±10.0)個(F=5.7，P<0.05)均增加，差異有統計學意義。而與IMQ誘導的雄性小鼠PCNA陽性細胞表達數量比較，IMQ誘導的雌性小鼠PCNA陽性細胞表達數量變化差異無統計學意義(F=3.0，P>0.05)。

2.6 免疫熒光法檢測小鼠皮膚內披蛋白的表達內披蛋白是角質形成細胞分化的標志性蛋白，陽性表達呈綠色熒光。由圖6 A可知，對照組小鼠內披蛋白表達分布在角質層和棘層上方，由圖6 B、C可知，IMQ誘導的雄性小鼠和雌性小鼠內披蛋白表達增強且在表皮各層均有分布。

3 討論

目前銀屑病病理機制的探究和新的抗銀屑病治療藥物的開發已經取得了較大的進展，但仍有待進一步研究。開發與人類銀屑病相似的動物模型有利于加速這一進程，目前銀屑病動物模型主要有：自發型動物模型、誘導型動物模型、轉基因型動物模型、以及異體種植模型[6-7]。IMQ是toll樣受體激動劑，主要用于人乳頭瘤病毒引起的生殖器和肛周疣的局部治療。臨床發現IMQ會加重控制良好的銀屑病患者的病情，這不僅發生在治療區域，也發生在之前未受影響的遠處皮膚部位。研究[8-9]發現使用IMQ涂抹小鼠皮膚，可使小鼠產生類似人類銀屑病的皮膚表型和組織病理學變化。且IMQ 誘導的小鼠銀屑病模型具有運用廣泛、操作簡便等優點，故課題組建立IMQ誘導的小鼠銀屑病模型并對其進行評價。

圖5 IMQ誘導的小鼠皮膚PCNA的表達

A：小鼠皮膚PCNA的表達 免疫組化×400；B：PCNA陽性細胞表達數量；a：對照組；b：模型組1；c：模型組2；與對照組比較：**P<0.01，*P<0.05

圖6 IMQ誘導的小鼠皮膚內披蛋白的表達 免疫熒光×800

性別差異在免疫反應中的機制復雜，可能涉及性激素對免疫、遺傳以及性別特異性行為和暴露等影響。雌激素通過影響T細胞和B細胞的發育以及自身反應性T細胞和B細胞的存活等增加自身免疫的風險[10]。在多種自身免疫疾病如類風濕關節炎、系統系紅斑狼瘡中女性的發病率均明顯高于男性。而在許多與自身免疫疾病有關的動物模型的研究中，性別差異也會對模型的建立造成一定的影響，如在自發性糖尿病Torii-Leprfa大鼠中，葡萄糖和脂質異常、性功能障礙、微血管病以及骨質疏松癥等均存在性別差異的影響[11-12]。但是在IMQ誘導的小鼠銀屑病模型中性別差異對模型建立的影響尚未報道。為了探究這一問題，實驗分別選用雄性小鼠和雌性小鼠建立銀屑病模型，從小鼠皮損改變、皮損PASI評分、小鼠皮膚組織病理學改變、脾臟和胸腺指數變化以及角質形成細胞增殖和異常分化等來評價IMQ誘導的小鼠銀屑病模型，并探究性別差異是否對該模型的建立產生影響。本實驗結果顯示與對照組小鼠相比，IMQ誘導的雄性小鼠和雌性小鼠皮膚均表現出紅斑、鱗屑、增厚、并在1～5 d持續加重，PASI評分也呈相同結果。從小鼠皮膚組織病理學上觀察可知，IMQ誘導的小鼠表皮增厚、表皮淺層可見毛細血管擴張、炎細胞浸潤、角質層可見角化不全、顆粒層變薄甚至消失、棘層肥厚并有表皮突下延，雄性小鼠和雌性小鼠皮膚組織病理學變化相似。同時IMQ誘導的小鼠脾臟指數增大，雄性和雌性小鼠脾臟指數變化差異無統計學意義。從PCNA和內披蛋白的表達情況可知，IMQ誘導的小鼠角質形成細胞表達數量增多，且存在異常分化現象，雄性小鼠和雌性小鼠PCNA和內披蛋白表達差異無統計學意義。這些結果均顯示 IMQ誘導的小鼠皮膚紅斑、增厚、鱗屑、表皮改變(棘皮癥，角化不全)方面非常類似于人類型銀屑病，且性別差異對IMQ誘導的小鼠銀屑病模型幾乎沒有影響。因此IMQ誘導的小鼠銀屑病模型可以為銀屑病機制研究和抗銀屑病藥物開發提供實驗基礎，并且在使用IMQ誘導小鼠銀屑病模型時，可以不用考慮小鼠性別差異對模型建立的影響。