iTRAQ法分析原發(fā)性慢性閉角型青光眼患者血漿中蛋白組學(xué)變化

李 倩， 張立宇， 蔣正軒，沈 兵，許育新

青光眼是一類以高眼壓為危險因素并具有特征性、不可逆性視野缺損的進展性視神經(jīng)病變，是全球第二位致盲性疾病。原發(fā)性慢性閉角型青光眼(chronic primary angle-closure glaucoma,CPACG)是我國最常見的類型，在我國40歲以上自然人群中致盲率達(dá)38.3%[1]。迄今為止，CPACG的發(fā)病機制并未完全闡明。現(xiàn)利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析聯(lián)合同位素標(biāo)記相對與絕對定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)鑒定CPACG患者血漿中的差異蛋白(different proteins，DEPs)，通過生物信息學(xué)分析，試圖發(fā)現(xiàn)該病血漿中存在的關(guān)鍵蛋白和參與疾病發(fā)生的主要信號通路，找出疾病可能存在的血漿標(biāo)志物，明確發(fā)病機制，對臨床的診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2019年2～9月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科收治的CPACG患者10例，其中男女各5例，年齡64～72(67.8±3.64)歲。同時收集年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異的白內(nèi)障患者10例作為對照組，其中男女各5例，年齡61～70(65.8±3.82)歲。本研究獲安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)CPACG患者納入標(biāo)準(zhǔn)：① 符合慢性青光眼診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；② 眼底視神經(jīng)損害和特征性視野缺損；③ 房角鏡及OCT顯示前房角關(guān)閉的患者；④ 患者眼壓高于2.79 kPa且沒有藥物干預(yù)。

CPACG患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)于其他疾病的閉角型青光眼患者；②以前做過青光眼手術(shù)或藥物干預(yù)的患者；③患有影響血液中相關(guān)蛋白變化的疾病，例如自身免疫性疾病、感染性疾病的患者；④有高血壓、糖尿病、高度近視、腦血管疾病等青光眼高危因素的患者。

對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡、性別、民族、居住地區(qū)無統(tǒng)計學(xué)差異的白內(nèi)障患者。

對照組的排除標(biāo)準(zhǔn)：有青光眼高危因素和家族聚集性青光眼疾病的患者，排除程度嚴(yán)重的，可導(dǎo)致繼發(fā)性青光眼的白內(nèi)障患者。

1.3 血漿樣品的采集與保存清晨采集患者空腹血液2 ml于抗凝管中，1 h內(nèi)前往實驗室進行離心，4 ℃、3 000 r/min，離心15 min，取上清液以200 μl/管分裝至離心管中，-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.4 標(biāo)記前樣本準(zhǔn)備去除高豐度蛋白，按照BCA法進行蛋白定量和SDS-PAGE電泳，然后樣品蛋白還原烷基化及酶解，參考FASP法酶解蛋白。

1.5 iTRAQ蛋白標(biāo)記取出iTRAQ試劑，室溫下離心至管底，異丙醇溶解；取50 μl樣品(100 μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入iTRAQ試劑后室溫反應(yīng)2 h；加水終止反應(yīng)；混合樣品振蕩，離心至管底；真空冷凍干燥樣品，留作iTRAQ分離鑒定。具體操作按照iTRAQ試劑盒說明書進行。

1.6 2D-LC-MS/MS分析質(zhì)譜采用Triple TOF 5600系統(tǒng)(AB SCIEX，美國)結(jié)合納升噴霧Ⅲ離子源(AB SCIEX, 美國)，噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓和霧化氣壓分別設(shè)為206.84 kPa和34.47 kPa，加熱器溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下(information dependent analysis，IDA)，一級TOF-MS單張圖譜掃描時間為250 ms，每次IDA循環(huán)下最多可采集35個電荷為2+到5+且單秒計數(shù)大于150的二級圖譜，每次循環(huán)時間皆為2.5 s，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離，動態(tài)排除設(shè)置為18 s，約等于色譜半峰寬。

1.7 序列數(shù)據(jù)庫檢索與數(shù)據(jù)分析收集到的數(shù)據(jù)用Protein Pilot Software v. 5.0(AB SCIEX, 美國)軟件進行分析，選用uniprot數(shù)據(jù)庫來鑒定肽段。根據(jù)信號強度值得到蛋白質(zhì)量，設(shè)定在2個重復(fù)樣品中上調(diào)或下調(diào),且log10差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.2，P<0.05的蛋白為DEPs。

1.8 GO分析與KEGG分析基因本體論(gene ontology, GO)分析總共有3個部分：分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process, BP)和細(xì)胞組成(cellular component, CC)。通過(http://metascape.org)網(wǎng)站進行GO分析，了解DEPs相關(guān)注釋及其主要功能。基于京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析是利用KOBAS聯(lián)機分析數(shù)據(jù)庫(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對DEPs進行了路徑分析。通過對GO分析和KEGG分析結(jié)果的整理，根據(jù)文獻(xiàn)閱讀進行比對篩查，發(fā)現(xiàn)可能的重要蛋白。

2 結(jié)果

2.1 DEPs的篩選定量分析顯示CPACG組與對照組比較有143個有統(tǒng)計學(xué)意義的DEPs，其中上調(diào)蛋白49個，下調(diào)蛋白94個(圖1)。

2.2 GO功能及富集分析結(jié)果通過對DEPs進行GO功能注釋(圖2)，根據(jù)GO分析發(fā)現(xiàn)DEPs主要涉及免疫應(yīng)答、對刺激的應(yīng)答、細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、蛋白激活傳遞、細(xì)胞基質(zhì)黏附等生物過程、蛋白結(jié)合，接觸反應(yīng)、分子功能調(diào)節(jié)等分子功能，細(xì)胞定位主要在細(xì)胞外區(qū)域。

圖1 DEPs表達(dá)火山圖

紅點：上調(diào)，綠點：下調(diào)，黑點：無統(tǒng)計學(xué)意義的變化

2.3 KEGG信號通路分析為了分析這些DEPs的相關(guān)功能，使用KOBAS在線分析工具來搜索KEGG信號通路。發(fā)現(xiàn)主要富集在補體凝集級聯(lián)反應(yīng)和代謝途徑(圖3)，圖4顯示DEPs富集的不同途徑。

圖3 DEPs KEGG富集信號通路圖

圖4 DEPs KEGG信號通路氣泡圖

2.4 重要DEPs通過DEPs KEGG分析，在表達(dá)上調(diào)的DEPs中發(fā)現(xiàn)以下重要蛋白(表1)：對CPACG視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和GO分起保護作用的肝細(xì)胞生長因子激動劑(hepatocyte growth factor activator，HGFA),通過抗氧化應(yīng)激作用影響原發(fā)性閉角型青光眼進展的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase 3，GPx-3)、過氧化物酶(peroxiredoxin-2)；以及在致病機制中參與免疫反應(yīng)的補體4(complement 4，C4)、補體4結(jié)合蛋白(complement 4 binding protein，C4BP)。

表1 重要DEPs分析表

3 討論

本研究通過iTRAQ法對CPACG的血漿進行檢測分析，顯示在CPACG發(fā)展中的關(guān)鍵蛋白和主要信號通路 。其主要結(jié)果如下：①鑒定出143種有統(tǒng)計學(xué)意義的DEPs，其中49種蛋白上調(diào)，94種蛋白表達(dá)下調(diào)；②GO分析DEPs在BP、CC、MF 3個方面的表達(dá)，結(jié)果顯示DEPs主要與免疫應(yīng)答、抗氧化應(yīng)激有關(guān)，與青光眼的發(fā)病機制相一致；③KEGG分析發(fā)現(xiàn)DEPs的主要作用通路，其中補體凝集級聯(lián)反應(yīng)是最主要的通路，很可能在青光眼疾病發(fā)展過程中起到重要作用，而補體系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)的重要部分，可能是CPACG發(fā)病的關(guān)鍵因素；④通過對質(zhì)譜結(jié)果的GO分析和KEGG分析并結(jié)合文獻(xiàn)，推測表1中的蛋白可能與青光眼存在重要聯(lián)系，闡述如下：

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)具有組織損傷再修復(fù)作用，在眼部組織中也有著豐富的表達(dá)，參與多種眼科疾病。HGF的基因多態(tài)性與閉角型青光眼疾病的易感性存在密切關(guān)系，具有CGC單體型的患者患閉角型青光眼的可能性更低[2]。Nie et al[3]發(fā)現(xiàn)HGF基因表達(dá)在青光眼中呈下降趨勢，治療后HGF基因表達(dá)增高但仍低于正常，并且通過生物信息學(xué)分析，認(rèn)為HGF可作為青光眼治療預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。本研究檢測到青光眼患者血漿中HGFA顯著升高，但HGF濃度未見增多，認(rèn)為HGFA的增高可能是由于青光眼患者HGF的表達(dá)低于正常人，發(fā)病時機體產(chǎn)生自我調(diào)節(jié)，使HGFA代償性增高。

氧化應(yīng)激是青光眼視神經(jīng)損傷機制之一，在青光眼中，細(xì)胞線粒體功能發(fā)生缺陷，Ca2+超載和活性氧水平升高，小梁網(wǎng)(trabecular meshwork,TM)和視網(wǎng)膜缺乏有效的抗氧化劑，最終導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)破壞，細(xì)胞衰變，從而引起組織的形態(tài)和功能損傷[4-6]。SOD、GPx-3、Peroxiredoxin能通過對抗氧自由基減少缺血和氧化應(yīng)激對細(xì)胞和組織的損害[7]。實驗結(jié)果中SOD、GPx-3、Peroxiredoxin-2在青光眼患者血漿中上調(diào)，可見氧化應(yīng)激在青光眼發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。然而Tang et al[5]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)不同亞型的青光眼患者外周血和房水中抗氧化物總量和單獨某種抗氧化物含量變化不同，開角型青光眼房水或外周血中總抗氧化物水平(total antioxidant status, TAS)降低但房水SOD和GPx表達(dá)水平增高，剝脫性青光眼TAS與對照組比較卻沒有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中，CPACG患者血漿SOD和GPx3的表達(dá)增多，與Goyal et al[8]實驗中房水SOD和GPx水平增高一致。因此，平衡氧化物和抗氧化物是青光眼治療的新思路。

補體系統(tǒng)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在青光眼疾病中，補體系統(tǒng)通過免疫應(yīng)答對視神經(jīng)產(chǎn)生作用是近些年研究熱點。C4和C4BP是補體系統(tǒng)的一部分，Mohlin et al[9]通過豬視網(wǎng)膜和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)模仿視神經(jīng)退行性疾病，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以使補體系統(tǒng)發(fā)揮作用，減少視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。補體紊亂常常是青光眼疾病發(fā)展的原因之一，青光眼的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜在損傷前有局部補體上調(diào)和激活，C3抑制劑可起到一定的治療作用[10]。C3是補體系統(tǒng)的重要成分，C1Q是補體系統(tǒng)的激活成分，然而，本研究中僅檢測到C4和C4BP增多而C3和C1Q并未增多，認(rèn)為與補體系統(tǒng)的改變一般早于青光眼視神經(jīng)損傷有關(guān)，CPACG多無明顯的發(fā)作癥狀，前來就醫(yī)時大都已有嚴(yán)重視神經(jīng)損傷，此時機體已產(chǎn)生自我保護反應(yīng)，對紊亂的補體進行調(diào)整和清除，因此可能檢測不到C3和C1Q。實驗中C4顯著增多，具體功能和機制還需要將來進一步的研究驗證。