脂多糖通過JAK2/STAT3通路誘導腎小球內(nèi)皮細胞炎癥反應的研究

劉 燕，張曉翠，鄧 芳

腎小球內(nèi)皮細胞(glomerular endothelial cells，GECs) 與基底膜和足細胞共同組成腎小球濾過屏障，是腎臟發(fā)揮生理作用的基礎(chǔ)，腎臟疾病發(fā)生的一個標志性事件就是腎小球微血管通透性增高形成蛋白尿，GECs的損傷是其初始環(huán)節(jié)[1]。Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)途徑是許多細胞因子受體系統(tǒng)的組成部分，在細胞的增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等過程中廣泛存在。正常情況下信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcriptions, STATs) 蛋白為單體，被磷酸化后變?yōu)槎垠w形式，而JAKs活化后可以促使單體 STATs 磷酸化，得到相應的二聚體，所得產(chǎn)物會進入核內(nèi)，并和啟動子區(qū)的相關(guān)序列結(jié)合并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程[2]。研究[3]表明，JAK2/STAT3途徑很可能參與了腎臟的炎性反應病理過程， 敲除STAT3 基因小鼠模型抑制JAK2/STAT3通路的激活，能使腎組織炎癥及損傷作用減輕。但其在小鼠GECs(mGECs)中的作用機制尚未完全清楚。該研究旨在探討脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是否通過激活JAK2/STAT3信號通路誘導mGECs產(chǎn)生炎癥，為腎臟炎癥性疾病防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑健康雄性昆明小鼠10只，SPF級，4～6周，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。Ⅳ型膠原酶、內(nèi)皮細胞生長因子、胰蛋白酶及轉(zhuǎn)鐵蛋白(美國Sigma公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(以色列BI公司)；LPS(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(南京諾唯贊生物科技)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；實時熒光PCR引物(上海生工)；兔抗p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗體(美國CST公司)；兔抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(武漢三鷹)；增強化學發(fā)光(ECL)試劑盒(上海Tanon公司)；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、小鼠白細胞介素-6(interleukin- 6,IL-6)ELISA 試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1mGECs的分離和培養(yǎng) 小鼠在無菌操作下眼球放血，并取出其腎臟，去除被膜及髓質(zhì)，將皮質(zhì)在80目篩上輕輕研磨，并依次從120、200目篩濾過，離心取沉淀后使用0.1% Ⅳ型膠原酶消化并收集腎小球，將其接種于提前涂有1%明膠的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在含20% FBS、胰島素660 U/L、血管內(nèi)皮生長因子20 mg/L、肝素鈉100 mg/L、青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L的DMEM低糖培養(yǎng)基中，鏡下觀察腎小球貼壁后常規(guī)換液。21 d后進行細胞純化，純化后常規(guī)培養(yǎng)并傳代，第2代細胞采用形態(tài)學觀察，直接免疫熒光法對所分離mGECs進行鑒定。所有實驗均采用第3～8代細胞進行實驗，所有細胞置于飽和濕度、5% CO2、37 ℃的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)[3]。

1.2.2LPS細胞毒性檢測 將mGECs以1×104個/孔接種于96孔板中，不同濃度LPS(0.1～100 μg/L)刺激細胞24 h，10 μl CCK-8試劑混合到每個孔中，再培養(yǎng)4 h。酶標儀測量490 nm處的吸光度，對照組細胞中的平均吸光度值設(shè)定為100%生存力，處理結(jié)果表示為對照的百分比。

1.2.3siRNA轉(zhuǎn)染 JAK2、STAT3 6條siRNA由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成。將細胞接種至24孔板培養(yǎng)孔中，使轉(zhuǎn)染時細胞密度達30%～50%，去除孔板中的培養(yǎng)基，在每孔細胞中加入含有60 ml/L Buffer、2.5 ml/L siRNA、6 ml/L Reagent的無血清培養(yǎng)基500 μl，37 ℃培養(yǎng)48 h。未處理組細胞為空白對照組；使用control siRNA組為siRNA陰性對照組；siRNA 干擾組分別為siRNA 1組、siRNA 2組、siRNA 3組。Western blot分別檢測細胞JAK2和STAT3表達量，篩選出干擾效率最高的siRNA進行后續(xù)實驗。

1.2.4LPS和JAK2/STAT3 siRNA干預 mGECs細胞用DMEM低糖培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，將生長達80%融合的細胞接種于6孔板中，細胞接種密度為2×105個/孔，無血清同步化培養(yǎng)24 h后，分組進行處理：對照(control)組、 LPS組(LPS 0.1 μg/L、1 μg/L、10 μg/L)、JAK2siRNA+LPS(1 μg/L)組、STAT3 siRNA+LPS(1 μg/L)組，其中，siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，加LPS(1 μg/L)刺激24 h。

1.2.5細胞免疫熒光染色 將細胞種植于玻片上，適宜條件培養(yǎng)至80%融合時，室溫下用4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3次。0.1%聚乙二醇辛基苯基醚再次固定細胞4 min，10% FBS終止固定。在4 ℃孵育一抗P-JAK2(1 ∶ 200)、P-STAT3(1 ∶200)過夜，PBS清洗細胞3次，室溫下孵育羊抗兔二抗(1 ∶ 100)作用細胞30 min，DAPI細胞核染色2 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6Western blot檢測 將細胞置于冰上，PBS清洗后，收集細胞并提取總蛋白，測定各組蛋白濃度。按蛋白定量結(jié)果上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，恒流轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST洗膜后，在4 ℃孵育一抗JAK2(1 ∶ 2 000)、P-JAK2(1 ∶ 2 000)、STAT3(1 ∶ 2 000)、P-STAT3(1 ∶ 2 000)過夜，TBST洗膜后，室溫下孵育羊抗兔二抗(1 ∶ 5 000)2 h，再次TBST洗膜后，ECL顯色曝光。用Western blot條帶吸光度值進行分析比較。

1.2.7qRT-PCR反應 使用TRIzol Reagent試劑1 ml/孔提取各組細胞總RNA，并以提取的RNA樣品為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green法對cDNA樣品進行實時熒光定量PCR。引物序列見表1。反應條件為：95 ℃預變性10 min后進入循環(huán)；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，擴增40個循環(huán)；每組設(shè)3個復孔，采用2-△△Ct法分析相對表達量。

表1 PCR引物列表

1.2.8ELISA法檢測培養(yǎng)上清液細胞因子含量 收取各孔細胞培養(yǎng)上清液，5 000 r/min、4 ℃離心10 min，保存于 -80 ℃冰箱中。用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6含量。

2 結(jié)果

2.1 LPS的最適宜作用濃度及其對JAK2/STAT3的影響為研究LPS對mGECs活性的影響，CCK-8法檢測mGECs用不同濃度LPS(0.1～100 μg/L)干預24 h后細胞活性。與空白對照組相比，LPS(0.1～10 μg/L)未表現(xiàn)出對mGECs的毒性(F=3.145，P>0.05)，而LPS 100 μg/L組較對照組細胞活性下降11.37%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。Western blot結(jié)果顯示，在不同濃度LPS(0.1、1、10 μg/L)刺激后，JAK2磷酸化水平較對照組升高79%、172%、201%，差異有統(tǒng)計學意義(F=40.56，P<0.01)。STAT3磷酸化水平較對照組升高38%、144%、174%，差異有統(tǒng)計學意義(F=194.7,P<0.01)，且均呈劑量依賴關(guān)系。1 μg/L LPS處理后的P-JAK2和P-STAT3表達變化較對照組均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而各組總蛋白變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。免疫熒光示1 μg/L LPS刺激后mGECs的P-JAK2、P-STAT3表達量增多，見圖3。

圖1 CCK-8法檢測 0.1～100 μg/LLPS處理mGECs后細胞活力變化

1：空白對照組；2：LPS 0.1 μg/L刺激組；3： LPS 1 μg/L刺激組；4： LPS 10 μg/L刺激組；5： LPS 100 μg/L刺激組；與空白對照組比較：*P<0.05

2.2 siRNA的篩選Western blot結(jié)果顯示，3組JAK2 siRNA轉(zhuǎn)染后， 與空白對照組相比，JAK2的總蛋白表達量分別下降65.25%、56.78%、63.01%,差異均有統(tǒng)計學意義(F=1 539，P<0.05)。且siRNA1片段干擾后的JAK2總蛋白表達量減少最明顯。3組STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染后，STAT3的總蛋白表達量分別下降62.08%、59.54%、65.71%,差異均有統(tǒng)計學意義(F=2 170，P<0.05)。且siRNA3 片段干擾后的STAT3總蛋白表達量減少最明顯，即沉默效果最好，見圖4。qRT-PCR結(jié)果與之一致，見圖5。

圖2 Western blot法檢測0.1～10 μg/L LPS處理mGECs后JAK2/P-JAK2、STAT3/P-STAT3蛋白相對表達變化

1：空白對照組；2：LPS 0.1 μg/L刺激組；3： LPS 1 μg/L刺激組；4： LPS 10 μg/L刺激組；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 免疫熒光法檢測LPS處理mGECs后P-JAK2、P-STAT3蛋白表達變化 SP×400

A：空白對照組；B：LPS 1 μg/L組；1：P-JAK2；2：P-STAT3

圖4 轉(zhuǎn)染siRNA后mGECs的JAK2、STAT3蛋白表達量

1：空白對照組；2：空白+siRNA陰性對照組；3： 空白+siRNA 1組；4：空白+siRNA 2組；5：空白+siRNA 3組

圖5 轉(zhuǎn)染siRNA后mGECs的JAK2、STAT3 mRNA相對表達量

1：空白對照組；2：空白+siRNA陰性對照組；3： 空白+siRNA 1組；4：空白+siRNA 2組；5：空白+siRNA 3組；與空白對照組比較：**P<0.01

2.3 JAK2/STAT3 siRNA抑制JAK2-STAT3信號通路的激活與沒有處理的細胞(空白對照組)相比1 μg/L LPS處理細胞后JAK2和STAT3的磷酸化蛋白增多(F=825.2，P<0.01；F=561.9，P<0.01)，總蛋白變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； JAK2 siRNA組與STAT3 siRNA均能降低LPS刺激的mGECs中磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表達(P<0.01)，見圖6。

圖6 P-JAK2、P-STAT3 蛋白在mGECs中的相對表達量

1：空白對照組；2：LPS刺激組；3：LPS刺激+JAK2/STAT3 siRNA組；與空白對照組比較：**P<0.01；與LPS刺激組比較：##P<0.01

2.4 LPS刺激及JAK2/STAT3 siRNA處理mGECs后TNF-α、IL-6表達變化用ELISA法檢測TNF-α和IL-6的表達變化發(fā)現(xiàn)：LPS刺激后可以使TNF-α和IL-6表達上調(diào)(F=45.67，P<0.01；F=19.82，P<0.05)。JAK2/STAT3 siRNA預處理mGECs后TNF-α和IL-6的表達下降，見圖7。mRNA水平變化趨勢與之一致，見圖8。LPS+JAK2 siRNA組與LPS+STAT3 siRNA組炎癥因子IL-6、TNF-α差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖7 IL-6、TNF-α 的蛋白表達量

1：空白對照組；2：LPS組；3：LPS+JAK2 siRNA組；4：LPS+STAT3 siRNA組；與空白對照組比較:**P<0.01；與LPS組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖8 TNF-α、IL-6的mRNA表達量

1：空白對照組；2：LPS組；3：LPS+JAK2 siRNA組；4：LPS+STAT3 siRNA組；與空白對照組比較：**P<0.01;與LPS組比較：##P<0.01

3 討論

作為腎單位的一部分，也是原尿生成的部位，腎小球有豐富的血管網(wǎng)絡[1,4]。在健康個體中，腎小球濾過膜能保留血液中的血細胞和蛋白質(zhì)并有效過濾血漿，而在腎臟炎癥患者中，由于炎性細胞浸潤，纖維蛋白滲出，腎小球基膜損傷和新月體形成導致腎小球濾過屏障遭到破壞從而產(chǎn)生血尿和蛋白尿。mGECs是腎小球濾過屏障的組成部分，是濾過膜的內(nèi)層，排列在腎小球毛細血管腔。由于mGECs是首先暴露于血液動力學、免疫學或代謝損傷誘導損傷的細胞，并且與腎小球系膜細胞、足細胞相互作用，可能是腎臟炎癥發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)[1]。當培養(yǎng)在適宜的促炎刺激體外環(huán)境下，mGECs受外界刺激引起正常的形態(tài)和功能改變，損傷的mGECs表現(xiàn)為細胞形態(tài)的變化、特異性標志物的改變、分泌功能改變以及抗氧化能力減弱，導致活性氧簇的過度產(chǎn)生，引起一系列蛋白激酶的依次磷酸化[5]。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，在多種腎臟炎癥性疾病中均能誘導mGECs產(chǎn)生炎癥反應[6-7]。TNF-α、IL-6是腎臟炎癥性疾病的代表性炎癥因子，有研究[8]證實，LPS誘導mGECs的炎癥反應與TNF-α和IL-6的分泌呈正相關(guān)。因此，此次研究把炎癥信號通路中的關(guān)鍵蛋白作為研究對象，探討LPS 誘導的mGECs炎癥反應的機制。

多種信號通路參與LPS誘導的內(nèi)皮細胞炎癥，如核轉(zhuǎn)錄因子kappa B信號通路、AMP依賴的蛋白激酶信號通路[6,9]。JAK-STAT信號通路是重要的炎癥信號通路之一。在癌癥中可觀察到JAK/STAT信號通路異?；罨痆10]，并且其也參與類風濕關(guān)節(jié)炎和腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。LPS能在多種疾病中激活JAK/STAT通路[2,7]，本研究用Western blot法檢測不同濃度下LPS刺激細胞后的JAK2、STAT3的總蛋白及磷酸化水平，結(jié)果顯示，隨著LPS濃度的增高JAK2和STAT3的磷酸化水平也不斷提高，且呈劑量依賴性，而總蛋白的變化無統(tǒng)計學意義，結(jié)果與Chen et al[12]研究一致。LPS誘導細胞分泌TNF-α、IL-6。在IL-6高水平存在的情況下，P-JAK2和P-STAT3也會增加，IL-6是JAK2/STAT3信號通路的強誘導劑,IL-6與細胞膜上IL-6受體結(jié)合后能誘導JAK2/STAT3信號通路的活化，從而以正反饋形式促進炎癥反應的發(fā)生[13]。JAK2 siRNA和STAT3 siRNA處理后能降低蛙皮素誘導的大鼠胰腺腺泡AR42J細胞炎癥和凋亡[12]。本實驗中用siRNA影響細胞JAK2、STAT3的基因表達后其炎癥指標TNF-α、IL-6減少的結(jié)果與之一致。而對于其他信號通路對于腎小球內(nèi)皮細胞炎癥的影響，將會在后續(xù)的研究中進行探討。本研究表明，JAK2/STAT3信號通路的激活在促進mGECs炎癥過程中發(fā)揮了促進作用，而抑制JAK2/STAT3信號通路的激活能減輕LPS誘導的mGECs的炎癥損傷。綜上，在mGECs中，LPS可以通過JAK2/STAT3信號通路介導炎癥反應。