弱堿性蒽貝素氨水溶液灌胃對小鼠肝細胞有絲分裂的影響

何平，李開雙，饒偉源，鄒佳峻，曾憲彪

1右江民族醫學院檢驗學院，廣西百色533099;2廣西壯族自治區中醫藥研究院

蒽貝素是從野生紫金牛科酸藤子屬植物酸藤子[1]果實提取分離的純結晶。據《廣西藥用植物名錄》等中醫傳統書籍記載，酸藤子能驅除腸道絳蟲，治療風濕骨痛和婦女濕熱帶下等疾病。國外傳統醫學也用酸藤子治療感冒發熱、胃腸功能紊亂、肝炎、肝硬化腹水以及慢性皮膚感染等疾病，也用于避孕節育[2]。現代藥理研究發現，從酸藤子提取的蒽貝素是一種促細胞凋亡活性物質，對許多XIAP高表達腫瘤(胰腺癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5])細胞有促凋亡作用，此外很多研究也發現蒽貝素有肝損害保護[6]等作用。近年我們在研究蒽貝素對肝臟的保護作用過程中，發現蒽貝素對肝細胞有絲分裂是有影響的。推測蒽貝素極有可能是通過促進腫瘤細胞凋亡和破壞腫瘤細胞有絲分裂雙重途徑，發揮其抗腫瘤作用。腫瘤的生長持征是細胞分裂活躍和腫瘤組織無序增長，終止腫瘤細胞有絲分裂是抗腫瘤治療的有效途徑之一。2018年8月～2019年4月,蒽貝素抗腫瘤機理除了誘導XIAP高表達腫瘤細胞調亡外，是否還通過終止腫瘤細胞有絲分裂機理發揮其抗腫瘤作用，國內外相關研究少見報道。本研究觀察了蒽貝素對正常肝細胞有絲分裂的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器、試劑 昆明小白鼠50只，體質量(20±2)g，雌、雄各半，由廣西醫科大學醫學實驗動物中心提供。生產許可證號SCXK桂2016-0004。飼養于溫度(23±2)℃，相對濕度70%±5%的實驗室環境。蒽貝素標準物質(美國西格瑪公司，批號022M4726V),25%氨水(廣東光華科技股份有限公司，批號20180725)，無水乙醇(廣東光華科技股份有限公司，批號20180423)，甲醛(廣東光華科技股份有限公司，批號20150310)，蘇木素-伊紅染色液(雷根生物公司，批號DH0006)。電子天平(上海精密儀器廠)，病理切片機(德國萊卡公司)，生物顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.2 蒽貝素提取、弱堿性蒽貝素氨水溶液配制 按文獻[7]方法，從酸藤子果實提取分離的橙黃色結晶，不溶于水，可溶于堿性氨水溶液，易溶于乙醇，在避光密封條件下保存于5 ℃冰箱，2年內鑒定和使用。經理化常數、質譜、紅外光譜、1HNMR，13CNMR測定的數據與Mahendra等[8，9]報道的蒽貝素數據一致。弱堿性蒽貝素氨水溶液配制參照文獻[10]：精密稱取蒽貝素2.4 g(0.008 2克分子)，用30 mL無水乙醇預溶，加入等克分子量氨(以6.8 mL 0.25%氨水=0.001克分子氨計，0.008 2克分子氨約等于56 mL 0.25%氨水)混勻，水浴加熱(52 ℃)，減壓蒸發(-0.8帕)，揮除乙醇，再以0.025%氨水調整剩余藥液至1 200 mL，使之成質量濃度為2 mg/mL(以蒽貝素量計，下同)母溶液備用，實驗時取母溶液用0.025%氨水稀釋成0.02、0.01.0.001 25 mg/mL弱堿性蒽貝素氨水溶液(pH值8.2)使用。

1.3 小白鼠分組及弱堿性蒽貝素氨水溶液灌胃 取昆明小白鼠50只，隨機分為蒽貝素高、中、低劑量組，溶劑組，空白組，每組10只。適應飼養1周后，蒽貝素高、中、低劑量組分別灌胃濃度0.02、0.01、0.001 25 mg/mL的弱堿性蒽貝素氨水溶液20 mL/kg，劑量分別為0.4、0.2、0.025 mg/kg，溶劑組灌胃0.025%氨水溶液(pH 8.2)20 mL/kg，空白組灌胃蒸餾水20 mL/kg， 均1次/d，連續7 d。末次給藥后次日，取肝臟作組織病理學檢查。

1.4 肝組織病理學檢查、分裂相肝細胞核物質觀察 取肝臟組織用10%甲醛溶液固定5 d，乙醇脫水，石蠟包埋，常規切片，片厚4.5 μm，蘇木素-伊紅染色。在100～400倍光鏡視野下觀察肝小葉及肝匯管區組織結構，肝細胞變性、壞死、分裂狀態。在400～1 000倍光鏡視野下觀察分裂相肝細胞核染色體松散、碎裂狀態，觀察胞核兩極或兩子代細胞核染色體均等狀況。以核物質著色特異、核染色體松散、碎裂、不均等分于胞核兩極或兩子代細胞為異常分裂肝細胞。以核物質著色與正常肝細胞相同、細胞核兩極或緊密相鄰的兩子代細胞核物質大致均等為正常分裂肝細胞。隨機取10個400倍視野，計數其中異常分裂肝細胞數和分裂相肝細胞總數(包含異常分裂肝細胞和正常分裂肝細胞)，計算10個視野中異常分裂肝細胞數占分裂相肝細胞總數的百分數。

2 結果

弱堿性蒽貝素氨水溶液灌胃給藥后，小鼠表現為中樞興奮、活動增多，喜歡攀爬。灌胃給藥7 d后，各組小鼠狀態正常，無小鼠死亡。蒽貝素高、中、低劑量組,溶劑組，空白組小鼠肝組織大體病理表現基本一致，各組肝組織切片觀察見：肝小葉結構正常，肝索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，中央靜脈和肝竇無明顯擴張。肝細胞無變性、壞死，從細胞和細胞核形態來看未見胞核染色體突變或細胞癌變的腫瘤細胞群。肝匯管區無明顯纖維結締組織增生，各級脈管及膽管未見明顯改變，未見有血液或膽汁瘀滯積聚征象。

正常分裂肝細胞核物質著色與正常肝細胞一致，無特異性，多為兩個緊密相鄰且相似的子代肝細胞。異常分裂肝細胞核物質著色特異，閃光透亮，核染色體呈松散麻花狀、碎片狀，條索狀或細粒狀。蒽貝素高、中劑量組分裂相肝細胞(正常分裂肝細胞、異常分裂肝細胞)數量較多，約占視野肝細胞總數5%～10%，呈點狀單個或雙個散在分布。可見分裂初期、中期、晚期異常分裂相肝細胞。在1 000倍光鏡下，分裂初期異常分裂肝細胞核物質或核染色體呈閃光透亮的麻花狀，充滿胞核(圖1)。分裂中期異常分裂肝細胞(圖2)核染色體散裂成碎片狀、條索狀或細粒狀，不均等分布于肝細胞核非中心位置，或細胞核兩極。分裂晚期異常分裂肝細胞核物質固縮成細粒狀，不均等分布于兩個子代肝細胞核(圖3)。這些分裂晚期子代肝細胞從核固縮形態和核染色體不均等看，都是已經死亡的肝細胞。死亡子代肝細胞數量較多，且與給藥劑量正相關，給藥劑量越大數量越多，最高可達視野肝細胞總數的10%。低劑量組正常分裂肝細胞和異常分裂肝細胞都極少見，甚至沒有，在400倍光鏡下，正常分裂肝細胞和異常分裂肝細胞占視野肝細胞總數不到0.5%。空白組和溶劑組少見正常分裂肝細胞，未見異常分裂肝細胞，在1 000倍光鏡下，正常分裂肝細胞占視野肝細胞總數不到0.5%。

蒽貝素高、中、低劑量組，溶劑組，空白組分裂相細胞總數分別為(35.4±3.95)、 (14.7±3.68)、(4.8±3.16)、(2.4±1.84)、(2.2±1.87)個/10個視野，異常分裂細胞數分別為(28.3±5.96)、(7.6±2.88)、(0.6±1.01)、0、0個/10個視野，異常分裂細胞數占分裂相細胞總數百分數分別為80.4%±16.1%、53.4%±19.8%、7.2%±11.8%，蒽貝素高、中劑量組各指標高于空白組或溶劑組(P均<0.05)。

3 討論

機體細胞活動，如細胞有絲分裂中的核染色體移動、細胞清除異物的吞噬活動等，都需要能量(ATP)參與。核染色體移動依靠蛋白微絲拖動，蛋白微絲工作必須有ATP參與才能完成。這些ATP則源自細胞內的物質代謝。碳水化合物的三羧酸循環和一些其他物質的旁路代謝是細胞內物質代謝和ATP產生的主要途徑，其中有電子傳遞過程，自然情況下電子傳遞是依靠輔酶Q來完成。輔酶Q的分子特征是帶長烷基側鏈的醌結構。有研究[10,11]認為，一些與輔酶Q有相似結構的醌類物質，如艾地苯醌等也有同樣的電子傳遞作用。蒽貝素的分子特征也是帶長烷基側鏈的對苯醌結構，Makawiti等[12]的研究認為帶長烷基側鏈的脂溶性苯醌，如艾地苯醌和蒽貝素等苯醌類物質，能很好地穿過細胞膜脂質，溶入線粒體，參與細胞內糖代謝的電子傳遞過程，活躍線粒體內的氧化磷酸化反應和三羧酸循環反應，加強線粒體內ATP產出，增強細胞活力。 本實驗中，蒽貝素高、中劑量組見大量異常分裂肝細胞，說明蒽貝素可以破壞肝細胞有絲分裂，使子代肝細胞死亡，其原因可能是蒽貝素參與了肝細胞內物質代謝和ATP產生過程，起電子傳遞作用，與輔酶Q協同或疊加強電子傳遞和ATP產出。較多的ATP可能加強了肝細胞生命活力和蛋白微絲收縮力，一方面，強大生命活力使細胞對肝細胞生長因子刺激響應加強，肝細胞分裂活躍；但另一方面，大量ATP給蛋白微絲提供能量，又使細胞核中的蛋白微絲產生過多的出力，核染色體受蛋白微絲過度拉動，變成松散狀態，或在向細胞極體移動中受拉過度而碎裂和不均等分配。核染色體不均等分配的有絲分裂最終結果是子代肝細胞死亡,最終形成無肝實質增長的無效肝細胞分裂。

圖1 分裂初期異常分裂肝細胞(HE染色，×1 000倍)

圖2 分裂中期異常分裂肝細胞(HE染色，×1 000倍)

圖3 分裂晚期異常分裂肝細胞 (HE染色，×1 000倍)

已有研究[13]表明，蒽貝素有第二線粒體源光氨酸酶激活劑樣分子黏性，能與X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)分子中的BIR3結構域結合，解除XIAP對光-天氨酸蛋白酶的抑制，引發下游聯級反應，最終激活caspase-3和導致細胞凋亡，有促進XIAP高表達腫瘤細胞凋亡作用，起抗腫瘤作用。本研究見蒽貝素破壞正常肝細胞有絲分裂，使異常分裂的子代肝細胞核死亡。腫瘤發生和發展的特征是細胞分裂非常活躍和腫瘤組織無序增長，終止其細胞分裂是抗腫瘤的有效途徑。蒽貝素能破壞肝細胞有絲分裂，我們推測其同樣潛在終止腫瘤細胞分裂活性，所以蒽貝素抗腫瘤機理除了誘導XIAP高表達腫瘤細胞調亡外，是否還通過終止腫瘤細胞有絲分裂途徑發揮其抗腫瘤作用，有待進一步用腫瘤細胞或荷瘤動物模型試驗驗證。