路鄧葡萄球菌的質譜技術鑒定及耐藥譜、臨床感染特征分析

劉曄華，穆紅，張堅磊，江雁，劉萍，王猛

天津市第一中心醫院，天津300192

路鄧葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌中毒力較強的菌種，可引起心內膜炎、骨髓炎、腹膜炎、淋巴結炎、眼炎、皮膚軟組織感染、血流感染、中樞神經系統感染、骨關節感染等[1]。對路鄧葡萄球菌的治療關鍵在于要和其他凝固酶陰性葡萄球菌區別對待，這需要準確的鑒定和藥敏譜。因路鄧葡萄球菌的分離鑒定很難，以往臨床上檢出率較少，因此鮮有臨床感染特征和耐藥譜的研究報道。伴隨MALDI-TOF質譜技術在臨床微生物實驗室的應用，其對于路鄧葡萄球菌的鑒定相比傳統的表型鑒定，具有更加快速準確的優勢。本研究應用質譜技術鑒定對路鄧葡萄球菌菌株進行了鑒定，并總結了其耐藥譜及臨床感染特點，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2014年1月～2019年6月天津市第一中心醫院住院患者中確診的醫院感染者臨床送檢標本。同一患者同一標本類型多次檢測相同的病原菌只選擇患者首次分離株，從這些送檢標本中檢出路鄧葡萄球菌48株，同期培養出葡萄球菌屬細菌8 527株，其中凝固酶陰性葡萄球菌6 291株。

1.2 菌株鑒定、藥敏試驗 采用法國生物梅里埃公司VITEK MS質譜儀對臨床送檢標本培養陽性菌株進行鑒定，定標菌株為大腸埃希菌ATCC8739，必須經過VITEK MS質譜兩點復核鑒定為路鄧葡萄球菌。藥敏試驗操作使用革蘭陽性菌藥敏卡片(VITEK-2 AST-GP639 Test Kit)，質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923，嚴格按照2018版臨床實驗室標準化研究所標準(CLSI)M100-S18規定的折點判定耐藥、中介和敏感，路鄧葡萄球菌的苯唑西林折點參照金黃色葡萄球菌，其余藥物折點判讀參照凝固酶陰性葡萄球菌。

1.3 路鄧葡萄球菌的耐藥譜、臨床感染特征分析方法 收集入選患者的臨床資料，分析路鄧葡萄球菌菌株質譜技術鑒定結果及藥敏試驗結果。應用WHONET5.6軟件統計檢出路鄧葡萄球菌的標本類型，病區分布和菌株耐藥率；應用本院電子病歷系統統計感染路鄧葡萄球菌的原發疾病。

2 結果

2.1 路鄧葡萄球菌的鑒定結果 共檢出路鄧葡萄球菌48株，占葡萄球菌屬細菌的0.56%(48/8 527)，占凝固酶陰性葡萄球菌的0.76%(48/6 291)。鑒定結果與VITEK MS V3.0數據庫比對相似率均> 99%，糖尿病足、右下肢動脈缺血和中耳炎的傷口分泌物以及血培養的菌株的質譜圖具有m/z 4291特征峰，典型圖譜見圖1，其他標本類型該峰譜缺失或者相對強度<10%，見圖2。

圖1 Ⅰ類路鄧葡萄球菌的VITEK MS質譜圖

圖2 Ⅱ類路鄧葡萄球菌的VITEK MS質譜圖

2.2 路鄧葡萄球菌對抗生素的耐藥情況 48株路鄧葡萄球菌中，11株屬于耐甲氧西林菌株，占比22.9%；所有菌株對青霉素和紅霉素耐藥率較高，分別占64.6%、37.5%；對克林霉素、復方新諾明、左旋氧氟沙星、慶大霉素、莫西沙星的耐藥率均<15%,分別占14.6%、12.5%、6.2%、4.2%、2.1%；對其他藥物均敏感，見表1。37株甲氧西林敏感菌株青霉素和苯唑西林不同MIC值組合中，青霉素敏感和苯唑西林都敏感的有17株，青霉素和苯唑西林均耐藥的菌株有4株，青霉素耐藥但苯唑西林敏感的菌株共計16株。

表1 48株路鄧葡萄球菌對抗生素的耐藥情況

2.3 路鄧葡萄球菌感染的原發病、感染標本類型和感染病區分布 路鄧葡萄球菌的感染患者男性占62.5%(30/48)，女性占37.5%(16/48)，平均年齡55歲(7～84歲)。原發病主要包括：尿毒癥(29.1%)、糖尿病(6.2%)、糖尿病足(6.2%)、前列腺增生(6.2%)、中耳炎(6.2%)、肝移植術后感染(6.2%)、類風濕關節炎(4.2%)、皮膚軟組織感染(4.2%)等。臨床分離出路鄧葡萄球菌的標本類型：腎周引流液占22.9%；其次是傷口分泌物，占20.8%；尿液占16.6%；耳分泌物和肛拭子各占6.2%；腹水、鼻拭子和膿各占4.2%；膽汁、靜脈血、透析液、前列腺液、皮膚拭子、氣管吸物各占2.1%。路鄧葡萄球菌感染的病區以復蘇室病房、移植外科、耳鼻喉科和泌尿外科等外科病區為首，占64.5%；其次是免疫科、中西醫科、國珍科等內科病區，占25.0%；重癥監護科占6.3%；感染科占4.2%。

3 討論

根據血平板上的菌落形態和溶血特征進行肉眼篩查，易將路鄧葡萄球菌和其他凝固酶陰性葡萄球菌歸為一類，視標本類型而定，有可能不再對其進行種的鑒定；依據傳統表型鑒定區分金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，易將路鄧葡萄球菌和金黃色葡萄球菌混淆；上機鑒定凝固酶陰性葡萄球菌的準確率受菌株原始生長狀態、活性等因素的影響較大，并且生化鑒定卡反應時間較長，12～17 h；MALDI-TOF質譜技術的菌種庫是依據微生物主要核糖體蛋白和大分子蛋白質建立的，保守性強且區分度好，該技術可以對菌株進行準確快速的鑒定，且對菌株的生長狀態要求不嚴[2]。因此，質譜技術的應用為分析路鄧葡萄球菌菌株的感染特征及耐藥特點提供了保障。本研究中采用質譜技術共檢出路鄧葡萄球菌48株，占葡萄球菌屬細菌的0.56%(48/8 527)，占凝固酶陰性葡萄球菌的0.76%(48/6 291)。

路鄧葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌，但其毒力卻與金黃色葡萄球菌相仿，可產生耐熱性DNA、結合型凝固酶、凝集因子。美國傳染病學會(IDSA)在其2015年《成人骨髓炎診斷管理指南》[3]中首次將路鄧葡萄球菌視為不同于其他凝固酶陰性葡萄球菌。歐洲心臟病學會2015年出版的心內膜炎治療指南[4]，強調了路鄧葡萄球菌在破壞性感染性心內膜炎的感染不同于其他同種，與其他凝固酶陰性葡萄球菌引起的心內膜炎不同，其主要侵犯固有瓣膜，通常引起嚴重的瓣膜損傷和贅生物形成，病情進展更為迅速，在使用抗生素的同時需早期行換瓣手術，且預后較差。有研究[5]表明,心內膜炎患者的血培養路鄧葡萄球菌檢測陽性率在6.3%～27.0%，但是需結合患者的臨床危險因素評估該菌為污染菌還是感染致病菌。本研究中取材自主動脈瓣贅生物的標本路鄧葡萄球菌檢出陽性(檢出率2.1%)，該標本是術中取材組織標本，價值極大。根據該菌的藥敏結果對該患者進行治療后，其好轉出院，這說明標本的取材和及時準確鑒定藥敏對臨床治療該菌相關的感染至關重要。

本研究中無菌部位臨床標本包括血液、關節液、組織、引流液，占比33.3%；有菌部位取材標本包括傷口分泌物、皮膚拭子、肛拭子等，占比47.9%，與Liu等[6，7]報道相似；尿液、前列腺液等標本占比18.8% 。研究認為，在深部臨床樣本分離到路鄧葡萄球菌，即使只是單次送檢培養陽性，也認為是致病的；但對于皮膚拭子、軟組織或在這種細菌的已知定植部位(如腹股溝、腋窩和鼻腔)分離到該菌，則需要根據患者的臨床感染情況慎重考是否為定植甚至污染[8]。

本研究中分離自糖尿病足、右下肢動脈缺血和中耳炎的傷口分泌物以及血培養的菌株，其質譜圖特征峰m/z 4291的相對強度均>50%，而其他的標本類型該峰譜缺失或者相對強度<10%，國內外尚未有相關報道，本研究中發現8株上述菌株，數量較少，因此該峰譜對應蛋白的意義是否與感染嚴重程度抑或是預后指標有關聯，有待繼續收集該類疾病培養為路鄧葡萄球菌的菌株進一步研究。

通過對路鄧葡萄球菌的耐藥分析發現，耐甲氧西林菌株占比33.3%；所有菌株對青霉素耐藥率較高占64.6%，對克林霉素、復方新諾明、左旋氧氟沙星、慶大霉素、莫西沙星的耐藥率均<15%，對其他藥物均敏感，該菌相比于其他常見的凝固酶陰性葡萄球菌菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥率較低[8]，這可能是由于上述葡萄球菌和路鄧葡萄球菌之間未進行抗藥性基因的水平遺傳轉移[9]。

國外研究[10]表明，對于甲氧西林敏感菌株，在皮膚和軟組織感染分離的同一菌株的藥敏，青霉素的MIC值比苯唑西林低3個MIC值，我們的研究標本取材不限于皮膚和軟組織感染標本，還包括血液、尿液、引流液、組織等標本類型，通過考察青霉素和苯唑西林不同MIC值組合的分離株數，37株甲氧西林敏感菌株中有17株是青霉素敏感的菌株，并且苯唑西林也都敏感，這些菌株可應用青霉素這個MIC值低的窄譜抗生素進行治療，而對于其余20株青霉素耐藥的菌株，除4株對苯唑西林顯示體外耐藥外，其余對苯唑西林均敏感，這些菌株需應用苯唑西林等抗生素治療。

綜上所述，應用質譜技術鑒定路鄧葡萄球菌具有快速準確的特點，路鄧葡萄球菌對青霉素和紅霉素耐藥率較高,感染此菌的原發疾病主要有尿毒癥、糖尿病、前列腺增生等疾病，檢出標本類型主要有腎周引流液、傷口分泌物、尿液等，感染病區以外科為主。臨床對于該類菌株的抗感染治療，需根據微生物室出具的藥物MIC值報告，針對性選擇用藥。進一步的研究需收集更多臨床菌株，對其耐藥譜和所分離宿主的治療及預后綜合分析。