扁果枸杞表皮蠟質合成相關基因LbCER1的RNAi載體構建

袁惠君，高澤，王絹絹，鮑婧婷，馮再平

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州，730050)

寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)是西北半干旱地區重要的經濟林種，其葉、果實均可食用和藥用，尤其是其干燥果實——枸杞子，是一種享譽國內外的藥食同源滋補佳品[1]。在生產中，枸杞鮮果保質期僅2～3 d[2]，必須在短期內通過晾曬或烘干制成干品。但是，寧夏枸杞果實表皮蠟質極發達[3]，厚度可超過0.1 mm，保水性強，成為枸杞果實干制加工中的主要障礙。

寧夏枸杞果實表皮蠟質主要成分為C29烷烴，占蠟質總量的42.9%[3]。目前，對參與植物表皮蠟質烷烴合成代謝中的酶基因及其功能沒有完全鑒定，僅在擬南芥中取得少量的實驗證據表明，醛脫羰基酶(ECERIFERUM1，CER1)催化長鏈偶數碳脂肪醛脫羰基，轉化為長鏈奇數碳烷烴，影響C29烷烴及其他長鏈奇數碳烷烴、醇和酮的合成，是長鏈烷烴合成過程中的關鍵酶，與提高表皮保水性密切相關[4-5]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術是指利用基因工程技術使體內合成一些針對特定基因的短片段單鏈RNA與該基因的mRNA結合，形成部分雙鏈RNA，促使mRNA降解，從而特異地阻斷該基因在體內表達，獲得該基因缺陷株系的技術[6-7]。因該技術具有特異性強[8-9]、效率高[10]、能沉默基因家族和多基因[11]、基因沉默效果可傳代[12]等優點，成為近20年來最重要的鑒定基因功能[13]和選育經濟植物新品種[14-15]的方法之一。

扁果枸杞(Lyciumbarbarumssp. Bianguo)是寧夏枸杞的一個品種，不僅其果實營養價值優于其他品種[16]，也是一種表皮蠟質極為發達的抗旱耐鹽植物[17]。本文以扁果枸杞LbCER1基因為目標，構建LbCER1-RNAi植物表達載體，并通過凍融法轉入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) GV3101中，為進一步獲得LbCER1-RNAi沉默株系，鑒定LbCER1基因功能及選育適宜于干制加工的寧夏枸杞品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

含有LbCER1基因開放閱讀框的pMD-19質粒、pKANNIBAL質粒,由本實驗室保存，pART27質粒和根癌農桿菌GV3101菌株,由蘭州大學草地農業科技學院王鎖民教授實驗室贈送。

PCR擴增試劑盒、T-載體PCR產物克隆試劑盒、DNA膠回收試劑盒，TAKARA公司；DNA marker，Novoprotein公司；限制性內切酶、T4 DNA 連接酶，Thermo Scientific公司；質粒提取試劑盒，OMEGE公司；瓊脂糖和引物合成，上海生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；Genesy 96T型PCR擴增儀，西安天隆科技有限公司；5424R型高速冷凍離心機: 德國Eppendorf 公司；Nichipet ExⅡ型移液槍，日本立洋公司；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 以LbCER1為靶標的RNAi 中間載體的構建

根據LbCER1基因開放閱讀框序列選定1 469～1 840 bp區段作為RNAi 最佳靶位區段，該片段長372 bp，包含3個最佳RNAi作用位點。根據該片段序列設計引物，上游P1為5′-GGAGAGGACACGCTCGAG-AGCTTACCCCTGAGGCTGCAG(XhoI)，下游P2為5′-TTTCCTTACCAATTGGGGTACCAAAATCCATGATCGA-GACTAGCTTTCC(KpnI)，劃線部分為限制性內切酶酶切位點。以本實驗室已構建好含LbCER1開放閱讀框的pMD-19質粒為模板，用引物P1、P2通過PCR法擴增選定的靶位區段，PCR條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；循環33次，72 ℃終延伸10 min。

將PCR產物連接到T載體測序，正確的克隆提取質粒后用XhoI/KpnI雙酶切，回收小片段，同 T4連接酶與經同種限制性內切酶雙酶切并回收大片段的載體pKANNIBAL連接，得到重組克隆pKANNIBAL-LbCER1(+)，轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞。以P3、P4為引物，進行菌落 PCR擴增檢測陽性菌落。P3序列為5′-AGAAGACGTTCCAACCACG，P4序列為5′-AAAATCCATGATCGAGACTAGCTTTCC。挑取陽性菌落測序驗證pKANNIBAL-LbCER1(+)質粒構建的正確性。

以含LbCER1開放閱讀框的pMD-19質粒為模板，以P5、P6為引物，進行PCR擴增，得到插入片段的負向產物。P5序列為5′-TTCGAAATCGATAAGCTTAAAATCCATGATCGAGACTAGCTTTCC-3′(HindⅢ)，P6序列為5′- TTAAAGCAGGACTCTAGAAGCTTACCCCTGAGGCTGCA-G-3′(XbaI)。測序驗證序列正確后，提取質粒，用HindⅢ/XbaI雙酶切，回收小片段，再次與經HindⅡ/XbaI雙酶切并回收大片段的pKANNIBAL-LbCER1(+)質粒連接，得到重組的中間載體pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)，轉化至 DH5α 感受態細胞。以P7、P8為引物，進行菌落 PCR擴增檢測陽性菌落。P7為5′-CGGTAAGGATCTGAGCTACAC-3′， P8為5′-AAAATCCATGATCGAGACTAGCTT-TCC-3′。挑取陽性菌落提取質粒，用XhoI/XbaI雙酶切質粒后電泳檢測pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質粒構建的正確性。

1.3.2 植物表達載體的構建及根癌農桿菌的轉化

將測序正確的pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質粒用NotI酶切，與經同樣酶切回收的pART27 載體用T4連接酶相連，構建植物RNAi 表達載體pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)轉化大腸桿菌，提質粒進行酶切驗證。

用凍融法將pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)導入根癌農桿菌GV3101，陽性菌落用引物P3、P4做正向片段菌落 PCR驗證。

2 結果與分析

2.1 LbCER1基因RNAi 最佳靶位區段的擴增

根據扁果枸杞LbCER1基因開放閱讀框序列設計RNAi最佳靶位區段長372 bp，加上設計引物時所帶的酶切位點和T載體連接區域共計40 bp，PCR產物預期長度應為412 bp。電泳結果表明，在250～500 bp有明顯條帶(圖1)，符合預期結果。測序分析也證明該PCR產物序列與LbCER1基因相應序列相似度為100%。

圖1 LbCER1基因RNAi靶位區段PCR擴增產物Fig.1 PCR production of LbCER1 gene’s targeted segments for RNA interference注：M-DNA marker(下同); 1～4泳道為PCR擴增產物

RNAi載體靶基因序列長度、位置的選擇都將影響基因沉默的效率和效果。一般認為，用于RNAi的基因片段長度在200～1 000 bp 都能發揮作用。在植物中，通常構建發卡狀RNA(hairpin RNA，hpRNA)所選靶序列長98～853 bp可達到較高的沉默效率，其轉化植株沉默效率可達66%～100%，平均90%[10]。RNAi載體靶基因序列通常以mRNA開放閱讀框區域作為設計RNAi的作用靶點，一般在基因轉錄起始位點下游100 bp以后[8]。本文選取的RNAi作用靶基因長372 bp，位于扁果枸杞LbCER1基因開放閱讀框序列1 469～1 840 bp區段，在GenBank中經BLAST全基因組掃描及序列同源性分析表明，所選靶序列與其他基因序列沒有同源性，不會引起多基因沉默。因此， RNAi載體構建設計合理，預期能對靶基因產生滿意的沉默效果。

2.2 RNAi中間載體的構建

以P3、P4為引物，進行菌落 PCR檢測pKANNIBAL-LbCER1(+)質粒構建結果，在500～750 bp接近500 bp處有明顯條帶(圖2-a)。由于上游引物P3起始于CaMV 35S啟動子的一部分，距離XhoI酶切位點長141 bp，因此，預期正向片段PCR擴增產物長513 bp。電泳結果符合預期，測序結果與LbCER1基因序列也一致，表明LbCER1正向片段插入正確。

以P7、P8為引物，擴增pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質粒中LbCER1的負向片段，由于下游引物P8終止于載體OCS terminator的一段序列，從XbaI酶切位點到引物P8長115 bp，因此預期負向片段的PCR擴增產物長487 bp。電泳結果顯示，在接近500 bp處有明顯條帶(圖2-b)，符合預期結果，表明LbCER1負向片段插入正確。

XhoI/XbaI雙酶切質粒pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質粒，電泳后，在5 000～6 000 bp、1 000～2 000 bp分別有明顯的條帶(圖2-c)。由于pKANNIBAL空載質粒為6 063 bp，其中包含767 bp的間隔序列——丙酮酸脫氫酶激酶內含子序列(PDK intron)，雙酶切后的質粒片段去掉PDK intron序列，又保留了兩端各4 bp的酶切位點，因此應為5 234 bp，與雙酶切后電泳圖中位于6 000～8 000 bp的條帶相符。根據pKANNIBAL質粒序列分析，正向片段距離PDK intron為8 bp，PDK intron與反向片段之間為21 bp，因此雙酶切后LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)片段預測長度為1 540 bp，也與雙酶切電泳圖中位于1 000～2 000 bp的條帶位置相符，表明pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質粒構建成功。

研究表明，RNAi載體若僅含1段正向序列或其反向序列，則沉默效率僅為10%左右，但是如果載體構建成正向序列-間隔序列-列反向序列，形成hpRNA，其沉默效率可達到50%[18-19]，而具有“正向序列-內含子-反向序列”的ihpRNA載體沉默效率可達到90%～100%[20]。

a-PCR法檢測LbCER1正向片段插入pKANNIBAL載體；b-PCR法檢測LbCER1反向片段插入pKANNIBAL載體；c-XhoI/XbaI雙酶切法檢測載體中的LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)片段圖2 RNAi中間載體的構建Fig.2 Construction of RNAi intermediate vector注：圖a、b中1～6、1～10泳道為PCR擴增產物；圖c中1、2泳道為雙酶切產物

2.3 RNAi表達載體的構建

以P3、P4為引物，用菌落 PCR法檢測RNAi表達載體pART27中的LbCER1正向片段，預期片段長度應為513 bp。電泳結果表明，在500～750 bp靠近500 bp的位置有明顯條帶(圖3-a)，與預測相符，表明pART27中含有LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)序列。進一步用XhoI、XbaI雙酶切RNAi表達載體pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)，預測大片段應為pART27質粒的線性產物，大小為11 660 bp；小片段應為LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)，長度為1 540 bp。電泳檢測結果表明，在8 000 bp之上、1 000～2 000 bp分別有2條明顯的條帶(圖3-b)，與預期結果符合。上述結果均表明RNAi表達載體pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)的構建正確。

a-PCR法檢測載體pART27中的LbCER1正向片段，b-XhoI、XbaI雙酶切法檢測pART27載體中的LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)片段圖3 PCR法和限制性內切酶酶切分析RNAi表達載體構建結果Fig.3 PCR analysis and restriction enzyme digestion analysis of RNAi expression vector注：圖a中1～10泳道為PCR擴增產物；圖b中1、2泳道為雙酶切產物

2.4 含RNAi表達載體的根癌農桿菌GV3101的制備

以P3、P4為引物，用菌落 PCR法擴增含RNAi表達載體的根癌農桿菌GV3101菌株中的正向片段，在500～750 bp靠近500 bp的位置有明顯條帶(圖4)，與預測的513 bp相符，表明轉基因根癌農桿菌GV3101菌株構建成功。

RNA干擾技術也存在不足，例如在快速繁殖的細胞中，RNAi可能不起作用[21]；RNAi可能引起同源基因的沉默；siRNA和反義RNA都有可能引發基因沉默[19]，因此當表型出現時，需要進一步驗證；沉默效率與dsRNA的長度之間的關系不確定，一般是雙鏈RNA的臂越短，沉默效率越低[22-24]。因此，本文構建的LbCER1-RNAi轉基因根癌農桿菌株最終的沉默效果需要通過檢測扁果枸杞遺傳轉化苗中LbCER1的表達量和表型等多方面證據證明。

圖4 PCR法鑒定含RNAi表達載體的根癌農桿菌GV3101Fig.4 Identify Agrobacterium tumefaciens GV3101 containing RNAi expression vector by PCR注：1～4泳道為PCR擴增產物

3 結論

本文克隆了扁果枸杞LbCER1基因開放閱讀框中1 469～1 840 bp區段，將其通過不同的限制性內切酶雙酶切組合按正向和反向分別插入pKANNIBAL載體中PDK intron的兩側，構建了具有LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)發卡狀反向重復序列的pKANNIBAL載體，并將該反向重復序列通過酶切、連接轉入RNAi表達載體pART27，再用凍融法將pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)載體轉化根癌農桿菌GV3101，得到含有LbCER1-RNAi質粒的根癌農桿菌GV3101菌株，為進一步鑒定CER1基因在旱生植物表皮蠟質烷烴合成過程中的功能，揭示表皮蠟質與植物保水性的關系，培育適宜干制加工的果蔬新品種奠定基礎。