脫脂牦牛乳硬質干酪成熟期間水溶性多肽的抗氧化活性

豆佳毓，梁琪，張炎

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室(甘肅農業大學)，甘肅 蘭州，730070)

牦牛乳蛋白質質量分數達4.9%～5.9%[1]，為普通牛乳的1.6～1.9倍。牦牛乳硬質干酪是喜馬拉雅山脈沿途國家重要的傳統乳制品，也是富含乳酸菌的活菌產品，成熟周期長，可達2年甚至更長。全脂牦牛乳硬質干酪中脂肪質量分數可達47.5%[2]，成熟過程中脂肪和蛋白質同時發生降解，并且微生物數量和菌群結構不斷發生改變，因此有復雜生化變化。脫脂干酪是國際常見的一種干酪品種，由于不含脂肪，成熟過程中主要是微生物菌群分泌蛋白酶，水解蛋白質生成各種肽，其中抗氧化活性肽近年受到國內外越來越多的重視。GUPTA等[3]研究表明，普通全脂牛乳切達干酪成熟時間顯著影響蛋白肽的抗氧化活性。LU等[4]研究普通全脂牛乳切達干酪水溶性提取物的抗氧化活性，發現隨成熟時間的增加，該提取物表現一定的抗氧化特性。目前脫脂牦牛乳硬質干酪水溶性多肽及其抗氧化活性與成熟時間的關系未見報道。現代工業干酪生產所用發酵劑以乳酸菌發酵劑為主，成熟過程中干酪內微生物是一個動態系統，其菌群結構隨成熟時間而變化，影響干酪的蛋白降解[5]。ROCHA等[6]研究表明酪蛋白被來自發酵劑微生物菌群分泌的蛋白酶和肽酶水解成各種生物活性肽，微生物數量可影響蛋白質降解，從而影響肽的活性強弱。乳酸菌是重要的益生菌，可直接對宿主產生益生作用或產生有益代謝物[7]。曲秀偉等[8]研究表明切達干酪在益生菌的作用下產生具有抗氧化活性的小分子多肽。宋雪梅等[9]研究了硬質干酪成熟過程中發酵劑乳酸菌自溶以及氨肽酶活性變化。目前對脫脂牦牛乳硬質干酪乳酸菌及菌落總數與成熟時間的相關性以及與水溶性肽濃度的關系未見報道。本試驗通過0～6個月的成熟期，探索脫脂牦牛乳硬質干酪成熟期間水溶性多肽濃度、抗氧化活性及微生物數量的動態變化并進行相關性分析，以期為牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抗氧化活性的作用機理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳,采自甘南藏族自治州。

883型發酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)，丹尼斯克公司；凝乳酶(皺胃酶、牛胃蛋白酶)，北京多愛特生物科技有限公司。

Folin酚試劑、DPPH試劑、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、檸檬酸鈉、NaCl、均為分析純;營養瓊脂、蛋白胨、牛肉膏,均為生化試劑。

1.2 儀器與設備

9NDS-50A型太陽能電動牛奶分離器，青海康平太陽能電動牛奶分離器廠；真空包裝機，溫州市大江真空包裝機械有限公司；723型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；PHS-3C 精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；真空冷凍干燥機，Scientz-ND寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫脂牦牛乳硬質干酪制備

脫脂牦牛乳制備工藝流程如下：

新鮮牦牛乳→過濾→檢驗→脫脂(牛奶分離器，13 000 r/min，脫脂率>99.95%)

脫脂牦牛乳硬質干酪制備，參考馬歡等[10]方法：

脫脂牦牛乳→巴氏殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(35 ℃)→添加發酵劑(0.006 25 g/L)→添加CaCl2(0.30 g/L)→添加凝乳酶(質量分數0.67%)→凝乳→切割→二次加熱→排乳清→攪拌、加鹽(用量為凝塊質量的2%)→水浴(45 ℃，10 min)→堆釀(30 min)→壓榨成型(4～5 h)→真空包裝→成熟

1.3.2 牦牛乳硬質干酪出品率測定

參考石永祺等[11]方法，測得脫脂牦牛乳硬質干酪出品率。干酪生產過程中，出品率與水分含量密切相關。為了得到精確的脫脂牦牛乳干酪的出品率，采用校正出品率進行比較。將水分調整到45%，可知脫脂牦牛乳干酪校正出品率。由表1可知，全脂牦牛乳硬質干酪的出品率優于脫脂牦牛乳硬質干酪，全脂干酪的實測出品率較脫脂干酪高25.68%。

表1 脫脂牦牛乳對干酪出品率的影響Table 1 Effect of skim yak milk on cheese yield

注：數據表示形式為平均值±標準誤差；*代表數據來源于文獻[11]

1.3.3 脫脂牦牛乳硬質干酪基礎理化指標測定

1.3.3.1 蛋白質含量測定

參考GB5009.5—2016中的凱氏定氮法進行測定。

1.3.3.2 水分含量測定

參考GB5009.3—2016中的直接干燥法進行測定。

1.3.3.3 pH值測定

參考馬歡等[12]方法，稱取2 g干酪樣品，蒸餾水和干酪以質量比10∶1混合，勻漿后將漿液用pH計測定。

1.3.4 脫脂牦牛乳硬質干酪水溶性多肽提取液制備

參考RIZZELLO等[13]方法制備水溶性多肽提取液(water soluble polypeptide extract,WSPE)，將提取液真空冷凍干燥后保存至-18 ℃進行后續的測定，經課題組前期研究已經發現此類提取物為具有活性的肽類物質。

1.3.5 水溶性多肽濃度測定

HERNANDEZ -LEDESMA等[14]研究結果表明，具有抗氧化活性的肽分子質量在1 kDa左右，而Peptone中分子質量<1.4 kDa的小肽組分更為豐富，因此Peptone-folin-酚法可相對準確地測定發酵乳制品蛋白中小分子肽的質量濃度[15]。繪制標準曲線如圖1所示，Peptone濃度與吸光值呈現良好的線性關系，回歸方程為y=0.008 93+0.563 71x，R2=0.996 46。

圖1 多肽濃度標準曲線Fig.1 Standard curve of polypeptide concentration

參考邢美孜等[15]方法稍作修改。通過對待測樣品吸光值A500nm的測定，計算相應水溶性多肽濃度，如公式(1)所示：

C/(g·L-1)=C0×N

(1)

式中，C,樣品質量濃度；C0,標準曲線中查得質量濃度；N,稀釋倍數。

1.3.6 脫脂牦牛乳硬質干酪水溶性多肽抗氧化活性測定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除率測定

參考XIN等[16]方法并稍作修改，稱取20 mg DPPH 定容至500 mL無水乙醇，50 g凍干樣品溶于1 L去離子水。試驗分為樣品組(2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液)、對照組(2 mL乙醇+2 mL樣品溶液)和空白組(2 mL DPPH溶液+2 mL乙醇)。不同樣液充分混勻，靜置30 min后在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率計算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0、A1、A2分別為空白組、對照組、樣品組的吸光度。

(3)

1.3.6.3 還原力測定

參考GU等[17]方法。向試管中依次加入1 mL WSPE (15 g/L)， 2.5 mL 1%(質量分數)鐵氰化鉀和2.5 mL磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L， pH 6.6)，混合均勻后50 ℃保溫20 min后放入4 ℃冰箱5 min暫停反應，加入2.5 mL 10%(質量分數)三氯乙酸溶液，放置10 min后離心，取上清液2.5 mL加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 1%(質量分數) FeCl3，混勻后室溫放置10 min，測其700 nm處的吸光度。還原力以吸光值表示，吸光值越高還原力越強。

1.3.6.4 羥自由基(OH·)清除率測定

羥自由基(OH·)清除率測定如表2所示。37 ℃反應15 min于510 nm處測定反應溶液的吸光值,計算如公式(4)所示[18]：

(4)

式中：Ax為樣品組吸光值；Ax0為不加顯色劑的吸光值，A0為空白對照吸光值。

表2 羥基自由基(OH·)清除率測定Table 2 Determination of hydroxyl radical (OH·) clearance

1.3.7 脫脂牦牛乳硬質干酪乳酸菌總數和菌落總數測定

1.3.7.1 乳酸菌總數測定

參考GB4789.35—2016的方法進行測定。使用MRS營養瓊脂培養基，無菌條件下準確稱取1 g干酪置于滅菌器皿中，加入無菌2%(質量分數)檸檬酸鈉溶液9 mL進行研磨，充分溶解干酪，攪拌均勻，按體積比1∶10做8個適當稀釋度的稀釋液，乳酸菌總數采用表面涂布法，于37 ℃培養24 h后計數。

1.3.7.2 菌落總數測定

參考GB4789.2—2016的方法進行測定。使用營養培養基，在無菌條件下準確稱取1 g干酪置于滅菌器皿中，加入無菌NaCl溶液9 mL進行研磨，充分溶解干酪，攪拌均勻，按體積比1∶10做8個適當稀釋度的稀釋液，采用傾倒平板法，于37 ℃培養24 h后計數。

1.4 數據分析

試驗每個處理重復3次，各項指標結果均采用3次重復平均值標準誤差表示，采用SPSS 22.0進行顯著性和相關性分析，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 脫脂牦牛乳硬質干酪基礎理化指標

如表3所示，在干酪樣品成熟的第1個月觀察到pH值下降，之后pH值呈現上升趨勢。這是由于干酪成熟初期乳糖分解產生乳酸導致pH值降低，隨著成熟時間的繼續增加，蛋白質分解，可溶性氮含量增加，pH值又繼而上升。在干酪成熟過程中水分含量呈現下降趨勢，成熟0 d全脂干酪的水分含量為41.85%[11]，脫脂干酪的水分含量較全脂干酪高25.75%。干酪在成熟過程中排出少量乳清，并且酶和微生物降解蛋白質，使干酪的網絡結構受到破壞，蛋白質基質的持水性下降。由表3可知，蛋白質含量在整個成熟期間呈現較小變動，這是由于隨成熟時間的延長，在凝乳酶和微生物胞內酶的作用下，酪蛋白不斷水解轉變成游離氨基酸，同時發酵劑利用干酪中的蛋白質為自身的生長代謝提供營養，導致蛋白質含量變化不大。

表3 基礎理化指標Table 3 Basic physical and chemical index

2.2 脫脂牦牛乳硬質干酪水溶性多肽濃度

根據標準曲線得出的回歸方程計算所測樣品質量濃度，得到水溶性多肽質量濃度，如圖2所示。由圖2可知，隨成熟時間的增加，脫脂牦牛乳硬質干酪WSPE質量濃度先增加后減小并趨于平穩，且WSPE質量濃度在不同成熟期差異顯著(P<0.05)。在第4個月時WSPE質量濃度達到最大值63.34 g/L，是成熟0 d干酪的5.44倍；在成熟至第2個月時WSPE質量濃度增長了98.35%，增長幅度最大。成熟初期，殘留凝乳酶降解蛋白質為中等和大分子質量肽，使干酪中的肽質量濃度升高，成熟后期，發酵劑蛋白酶進一步將中等和大分子肽降解為小分子肽和氨基酸殘基，相應的干酪中的多肽質量濃度降低。

圖2 干酪水溶性多肽濃度Fig.2 Soluble peptide concentration in cheese注：圖中不同小寫字母表示不同成熟期差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 脫脂牦牛乳硬質干酪成熟期間WSPE抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是穩定的自由基，若能將其清除，則表明樣品具有降低H2O2、烷自由基、過氧化自由基或脂質自由基連鎖反應的作用[19]。由圖3可知，脫脂牦牛乳硬質干酪在成熟過程中，隨成熟時間的增加，DPPH自由基清除率先增加后減小，在成熟4個月時達到峰值，且成熟各月份間DPPH自由基清除率存在顯著差異(P<0.05)。DPPH自由基清除率在脫脂牦牛乳硬質干酪WSPE中成熟4個月(52.39%)較成熟0 d(13.58%)增長了285.70%。本試驗表明，在成熟過程中發生蛋白質降解生成的小分子肽具有抗氧化活性。在4個月之后，DPPH自由基清除率下降，是由于部分小分子肽類物質繼續降解成氨基酸。成熟時間與DPPH自由基清除率在成熟0～4個月呈現良好的線性關系，線性擬合方程為y=13.534 49+9.198 32x，R2=0.995 58。

圖3 DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity

圖4 超氧陰離子自由基清除能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity

2.3.3 還原力

還原能力的測定是以樣品是否為良好的電子供體為指標，還原能力大的樣品使吸光值上升，同時與自由基反應，使自由基成為較為穩定的物質，還原力越強則抗氧化性越大[21]。由圖5可知，在脫脂牦牛乳硬質干酪成熟過程中，WSPE的還原力呈現先上升后下降的趨勢。還原力在脫脂牦牛乳硬質干酪WSPE中成熟5個月時最高，是成熟0 d(0.28)的2.23倍，且在成熟各月份間存在顯著差異(P<0.05)。成熟時間與還原力在0～4個月成熟期呈現良好的線性關系，線性擬合方程為y=0.284 37+0.060 54x，R2=0.985 40。李東花等[22]在研究普通全脂牛乳切達干酪水溶性提取物還原力的變化后指出，由于蛋白質在成熟過程中降解生成的小分子肽前期分子質量比后期大，還原力顯著低于后期生成的小分子肽。LEE等[23]證明了還原力與還原部分的供氫能力密切相關，而蛋白質水解產生與自由基反應的還原劑，以穩定和終止自由基鏈反應，提高還原力。

圖5 還原能力測定Fig.5 Deteminarion of reducing power

2.3.4 羥自由基(OH·)清除能力

羥自由基是活潑性最強、氧化性最大的自由基，對DNA、蛋白質和脂類有較強的結合能力，消除過多的氧化自由基，對與老化相關的疾病有預防作用[24-25]。由圖6可知，脫脂牦牛乳硬質干酪WSPE的OH·清除率在成熟前4個月隨成熟時間的增加而增大。成熟1個月時OH·清除率增長了104.39%；OH·清除率在成熟4個月時(49.54%)是成熟0 d (12.63%)的3.92倍；OH·清除率在脫脂牦牛乳硬質干酪成熟各月份之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 羥自由基清除能力Fig.6 Scavenging capacity against hydroxyl radical

2.4 成熟時間對脫脂牦牛乳硬質干酪乳酸菌總數和菌落總數的影響

2.4.1 成熟時間對牦牛乳硬質干酪乳酸菌總數的影響

乳酸菌總數在脫脂牦牛乳硬質干酪6個月成熟期內的變化情況如圖7所示。由圖7可知，乳酸菌總數整體呈現下降趨勢，成熟各月份間存在顯著差異(P<0.05)。乳酸菌總數在成熟0 d時最多，為8.42 lgCFU/g；隨成熟時間的延長，成熟4個月時乳酸菌總數減幅為9.89%；在成熟6個月的樣品中乳酸菌總數為6.17 lgCFU/g，是成熟0 d的73.28%。成熟時間與乳酸菌總數在6個月成熟期內呈現良好的線性關系，線性擬合方程為y=8.358 78-0.404 12x，R2=0.953 98。KARIMI等[28]研究曾經指出對于益生菌食品，活菌數至少要達到6 lgCFU/g，脫脂牦牛乳硬質干酪在成熟期間保持了較高的乳酸活菌數值。有學者在研究切達干酪指出乳酸菌作為抗氧化劑與羥自由基發生反應，阻止了羥自由基與蛋白質結合，蛋白質發生降解產生抗氧化肽，使得切達干酪具有抗氧化活性[22]。

圖7 成熟時間對牦牛乳硬質干酪乳酸菌總數的影響Fig.7 Effect of ripening time on the total number of Lactobacillus in hard cheese of yak milk

2.4.2 成熟時間對牦牛乳硬質干酪菌落總數的影響

菌落總數在脫脂牦牛乳硬質干酪6個月成熟期內的變化情況如圖8所示，由圖8可知，隨成熟時間的增加，菌落總數整體呈現下降趨勢。菌落總數在成熟0 d達到9.51 lgCFU/g；在成熟4個月時減幅最大，減少了8.00%，與乳酸菌總數變化相同；在成熟6個月時值為7.13 lgCFU/g，是成熟0 d的74.97%。菌落總數在脫脂牦牛乳硬質干酪成熟各月份間存在顯著差異(P<0.05)。成熟時間與菌落總數在6個月成熟期內呈現良好的線性關系，線性擬合方程為y=9.379 62-0.398 95x，R2=0.957 46。隨干酪的成熟，干酪的理化特性越來越不利于微生物的生長，如高鹽、低pH以及缺乏可發酵利用的碳源，使得發酵劑乳酸菌及菌落總數的數量緩慢下降，且低貯藏溫度使得菌落很難在其中增殖[29]。

圖8 成熟時間對牦牛乳硬質干酪菌落總數的影響Fig.8 Effect of ripening time on the total number ofbacterial colony in hard cheese of yak milk

2.5 各指標間相關性分析

表4 各指標間相關性分析Table 4 Correlation analysis between various indicators

注:*表示P<0.05(雙尾)，相關性顯著;**表示P<0.01(雙尾)，相關性極顯著

3 結論

脫脂牦牛乳硬質干酪成熟中蛋白質降解不受脂肪影響，因此更能體現蛋白質降解后的水溶性多肽功能活性。本研究對脫脂牦牛乳硬質干酪0～6個月成熟期WSPE質量濃度、WSPE抗氧化活性和微生物數量進行綜合分析，發現脫脂牦牛乳硬質干酪WSPE質量濃度隨成熟時間增加顯著增加；隨成熟時間的增加，4種抗氧化活性指標均呈現顯著增加并在第4個月時前三者達到高峰，還原力延續至第5個月達到高峰；微生物數量呈現下降趨勢。本試驗首次對脫脂牦牛乳硬質干酪成熟期間WEPE、抗氧化活性及微生物變化之間相關性進行研究，這對脫脂牦牛乳硬質干酪的理論研究和產業化發展有重大意義。對于脫脂牦牛乳硬質干酪成熟期間具有抗氧化活性的水溶性多肽分子結構信息有待進一步研究。