發(fā)酵前咖啡酸和迷迭香酸添加對干紅葡萄酒顏色與香氣的影響

李寧寧，張波*，牛見明，史肖，馬騰臻，韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)

在葡萄酒的購買和消費過程中，人們常會選擇色度較深、氣味較濃郁的產(chǎn)品，所以顏色和香氣成為評價紅葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)[1-2]。但是紅葡萄酒中的色素性質(zhì)不穩(wěn)定，并且呈香物質(zhì)易揮發(fā)，使得葡萄酒在陳釀過程中常會出現(xiàn)色澤質(zhì)量降低和香氣物質(zhì)流失的現(xiàn)象。因此，為了提升葡萄酒的品質(zhì)，通常會通過優(yōu)化釀造工藝等手段對葡萄酒的顏色和香氣做調(diào)整[3]。

研究表明，輔色反應(yīng)是一種天然有效提升葡萄酒色澤的方式[4]。其中，酚類化合物作為常見的輔色素物質(zhì)，借助其自身結(jié)構(gòu)中所含的π電子系統(tǒng)，可與缺少電子的花色苷烊鹽離子結(jié)合，形成“酚類-花色苷”復(fù)合物，從而保護花色苷結(jié)構(gòu)，達到穩(wěn)定和增強顏色的效果[5]。LAMBERT等[6]通過向模擬紅葡萄酒體系中加入黃酮醇和酚酸進行處理，與不加酚類物質(zhì)的對照相比，添加處理的試驗組樣品能夠使花色苷的色澤強度提高46%，穩(wěn)定性提升41%。而在酒精發(fā)酵前加入鞣花酸可使所釀造的干紅葡萄酒顏色穩(wěn)定性大幅提升，并且由于酚類物質(zhì)的加入，使得紅酒體系中花色苷等多酚浸出率也得到加強[7]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)構(gòu)類型酚類物質(zhì)的輔色效果亦有差異，這其中黃酮醇類在所測化合物中的輔色能力最強，酚酸次之，而黃烷醇類化合物的輔色效果相對較弱[8]。不過，TEIXEIRA等[9]在模擬試驗中發(fā)現(xiàn)，盡管黃烷醇類物質(zhì)的輔色能力不佳，但依然能引起處理樣品在視覺上的顏色變化。

在酚類物質(zhì)改善紅葡萄酒色澤的同時，有研究人員觀察到某些多酚類物質(zhì)還可與酒中的香氣化合物作用，影響后者在體系中的溶解度和揮發(fā)性，進而改變其感知程度[10]。ARONSON等[11]發(fā)現(xiàn)，柚皮苷和沒食子酸2種多酚在水溶液中可抑制香氣物質(zhì)的擴散。而通過在體積分數(shù)10%的水-醇溶液中加入一定量的兒茶素(>2 g/L)，可使己酸乙酯在體系氣相中的分配系數(shù)明顯降低[12]。類似的結(jié)果在添加兒茶素等物質(zhì)的飲料貯藏試驗中也有報道[13]。CHEN等[14]還檢測到，酚類物質(zhì)處理能有效改善葡萄酒的香氣復(fù)雜性和感官特性。同時，研究認為，酚類物質(zhì)和香氣化合物的作用程度可能與反應(yīng)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)[15]。

伴隨著葡萄酒科學(xué)研究的進展，相關(guān)的檢測技術(shù)和測試手段也在不斷改善和發(fā)展。除利用感官評價或是較為簡單的儀器對葡萄酒的品質(zhì)指標(biāo)進行測定和分析外，一些性能優(yōu)良、靈敏度高的分析設(shè)備也逐漸被應(yīng)用，這其中以超高效液相色譜-質(zhì)譜(ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UHPLC-MS)，以及氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等為代表的檢測儀器是目前在葡萄酒顏色分析和香氣測定過程中較為先進的技術(shù)工具[16-17]。曹鵬等[18]利用UHPLC-MS方法對陳釀前添加酚類輔色素的干紅葡萄酒進行了測定，其數(shù)據(jù)結(jié)果除可反映葡萄酒中單體、酰化、吡喃型花色苷的種類和含量外，還能對酒中的其他酚類化合物質(zhì)(黃酮醇、黃烷醇和酚酸等)進行判斷。而GC-MS在應(yīng)用到葡萄酒香氣分析以來，已有1 300多種物質(zhì)被明確的定性檢測出[19]。這些科研結(jié)果為揭示葡萄酒研究中的未解問題奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

但是，盡管有上述研究發(fā)現(xiàn)和技術(shù)手段的支持，到目前為止，有關(guān)酚類化合物參與的輔色化過程，以及對香氣的影響機制仍有很多疑問亟待闡明，特別是大量的試驗結(jié)果來自于模擬反應(yīng)體系，與真實的發(fā)酵條件有較大的區(qū)別。因此，研究酚類物質(zhì)在葡萄酒釀造過程中對顏色和香氣品質(zhì)的影響，將為相關(guān)的科研工作提供參考和幫助，對提升干紅葡萄酒的品質(zhì)有重要意義。咖啡酸是葡萄酒中主要的酚類化合物，迷迭香酸是咖啡酸的結(jié)構(gòu)類似物(由咖啡酸和丹參素酯化形成)，二者在結(jié)構(gòu)上相似，并且在自然界中均屬常見的多酚物質(zhì)。本試驗擬通過發(fā)酵前添加上述酚類化合物來研究其對干紅葡萄酒呈色效果及香氣物質(zhì)的影響，以期為進一步開展酚類物質(zhì)在葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄(VitisviniferaL., cv. Cabernet Sauvignon)，甘肅武威莫高釀酒葡萄種植基地，含糖量為23.3～24.0 °Brix。

釀酒酵母(D254)、乳酸菌(Oenococcusoeni)，法國Laffort公司；果膠酶，法國Lallemand公司；咖啡酸、迷迭香酸(食品級)，陜西潤生生物科技有限公司；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、2-辛醇、甲酸、甲醇、乙腈(色譜純)，美國Sigma公司；L-蘋果酸、L-乳酸(色譜純)，上海源葉科技有限公司；乙醛、偏重亞硫酸鉀、沒食子酸、Na2CO3、NaOH、I2、KI、淀粉(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；KCl、HCl、乙酸鈉、乙酸、NaCl(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。費林試劑、次甲基藍指示劑及酚酞指示劑等，均按GB/T 603—2002化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備進行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜、6460三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜、色譜柱(Poroshell 120 EC-C18，150 mm×2.1 mm×2.7 μm；DB-WAX，60 m×2.5 mm×0.25 μm)，美國Agilent Technologies公司；TRACE 1310氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific公司；固相微萃取裝置、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅萃取頭，美國Surpelco公司；TU-1810紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3EpH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干紅葡萄酒的釀制

赤霞珠葡萄，經(jīng)人工粒選去除霉?fàn)€及生青果實；除梗破碎后均勻分裝在9個20 L的不銹鋼罐中，添加60 mg/L SO2，20 mg/kg果膠酶，并進行未加酚酸、添加150 mg/L咖啡酸、添加150 mg/L迷迭香酸的處理[試驗前參考已有文獻報道[7]，并通過預(yù)實驗對添加的酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度(100、150、200 mg/L)]進行了篩選，最終確定使用量為150 mg/L)，每個處理3個平行；發(fā)酵前樣品先在4 ℃條件下恒溫冷浸漬48 h，之后解除溫度控制自然回溫至17 ℃，添加釀酒酵母啟動酒精發(fā)酵；待酒精發(fā)酵結(jié)束后，進行皮渣分離，添加商業(yè)乳酸菌啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵直到發(fā)酵結(jié)束；裝瓶陳釀6個月后取樣測定。

1.3.2 干紅葡萄酒理化指標(biāo)測定

酒精度，總糖，揮發(fā)酸，總酸，pH，游離SO2和總SO2參照GB/T 15038—2006葡萄酒、果酒通用分析方法進行測定。

1.3.3 干紅葡萄酒理化指標(biāo)測定

1.3.3.1 CIELAB顏色參數(shù)測定

利用紫外-可見分光光度計，以蒸餾水為參比，使用2 mm光程比色皿測定，儀器掃描范圍為400～700 nm，掃描間隔為1 nm。在D65標(biāo)準(zhǔn)白光源和10°觀察者視場條件下，計算CIELAB顏色參數(shù)L*(亮度)，a*(紅/綠色度)，b*(黃/藍色度)。同時根據(jù)公式(1)～公式(5)計算色差(ΔEab*)、亮度變化率(ΔL)、色飽和度變化率(ΔC)和色調(diào)變化率(ΔH)[21]：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

1.3.3.2 各類型花色苷比率測定

參照BOULTON[20]的方法測定輔色花色苷比率(CA)、游離花色苷比率(FA)和聚合花色苷比率(PA)。葡萄酒樣品先調(diào)節(jié)pH值為3.60，使用2 mm光程比色皿，采用分光光度計在520 nm下測定，并利用公式(6)～公式(8)計算各類型花色苷比率:

(6)

(7)

(8)

式中：Aacet為2 mL葡萄酒中加入20 μL 200 g/L乙醛，并避光靜置約45 min后的吸光值；ASO2為2 mL葡萄酒樣品中加入160 μL 50g/L SO2后的吸光值；Awine為100 μL葡萄酒樣品中加入1 900 μL模擬酒溶液后的吸光值(測量值乘以20，進行稀釋校正)；各吸光值測定前通過配有濾膜(0.45 μm孔徑)的微型注射器進行膜過濾。

1.3.3.3 總酚含量的測定

取1 mL樣品稀釋至10 mL，再取0.1 mL稀釋的樣品于10 mL的容量瓶中，加入6 mL純凈水，0.5 mL的福林-肖卡試劑，1.5 mL 200g/L的Na2CO3定容到10 mL。將配好的溶液在20 ℃下放置2 h，測定其在765 nm處的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.001 2X+0.042 4，R2=0.997 5)計算總酚含量，結(jié)果以沒食子酸計(mg/L)。

1.3.3.4 總花色苷含量的測定

吸取0.5 mL的葡萄酒，用pH=1.0的緩沖液[V(0.2 mol/L KCl)∶V(0.2 mol/L HCl)=25∶67]定容至10 mL，在室溫下平衡10 min后，測定其在521、700 nm處的吸光值，分別表示為A521、A700。用同樣的方法測定樣品在pH=4.5緩沖液[V(0.2 mol/L 乙酸鈉)∶V(0.02 mol/L 乙酸)=1∶1]下的吸光值，利用公式(9)、公式(10)計算總花色苷含量：

(9)

A=(A521-A700)pH1.0-(A521-A700)pH4.5

(10)

式中：M為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的分子量，493.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；比色皿光程為1 cm；ε為摩爾消光系數(shù)，28 000 L/(mol·cm)。

1.3.3.5 花色苷的UHPLC-MS測定

參照陳欣然等[21]的方法，采用UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜的注射器過濾后直接進樣。使用Poroshell 120 EC-C18色譜柱，以V(甲酸)∶V(水)=0.2∶100作為流動相A，V(甲酸)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=0.2∶50∶50作為流動相B。洗脫程序為0～27 min，90%A～10%B；27～28 min，44%A～56%B；28～33 min，90%A～10%B；洗脫時間均為3 min。ESI正離子模式下，離子源溫度350 ℃，霧化器壓力35 psi，干燥氣流速12 L/min，干燥氣溫度350 ℃，掃描范圍m/z100～1 000。

花色苷的定性通過樣品圖譜信息與保留時間信息對比進行判定。花色苷的定量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)物，采用外標(biāo)法定量計算其他花色苷含量(mg/L)。

1.3.4 干紅葡萄酒香氣指標(biāo)測定

香氣物質(zhì)的檢測參照魯榕榕等[22]的方法，采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)。

香氣化合物的萃取：取8 mL酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.5 g NaCl和20 μL內(nèi)標(biāo)物(2-辛醇，88.2 mg/L)，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后迅速密封，然后將樣品置于恒溫磁力攪拌器中，在40 ℃水浴中平衡30 min后繼續(xù)進行30 min頂空萃取。

GC-MS條件：使用DB-WAX色譜柱，升溫程序為初溫40 ℃保持5 min，之后以4 ℃/min升至180 ℃保持15 min，載氣流速1 mL/min，進樣口溫度240 ℃，采用不分流進樣；電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，傳輸桿溫度180 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z35～350。

香氣成分分析：香氣成分的定性采用質(zhì)譜信息、NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比，以及參考相關(guān)文獻相結(jié)合的方法進行定性分析；香氣成分的定量采用內(nèi)標(biāo)法進行半定量分析，各香氣成分含量(μg/L)=(各組分的峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量)/(內(nèi)標(biāo)物峰面積×進樣量)。

1.3.5 干紅葡萄酒感官評價

選擇10名具有一定釀酒經(jīng)驗和經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的人員(6名女性和4名男性)對3款所釀葡萄酒進行感官評定。供試酒樣以隨機順序提供給品嘗者。品鑒從視覺(顏色)，香氣(香氣強度、花香、果香)和風(fēng)味(甜味、酸味、酒體、余味長短、異味)共9個屬性方面進行，用8分結(jié)構(gòu)化數(shù)值進行量化，0代表沒有感覺，8表示感覺最為強烈。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2013對試驗所得數(shù)據(jù)進行處理，SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行多因素方差分析(Duncan法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標(biāo)

由表1可知，3種供試樣品的總糖含量均<4 g/L，酒精度在14.17%vol～14.42%vol，表明試驗所釀制的紅葡萄酒符合國標(biāo)中干型葡萄酒的基本要求。同時，各樣品的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度在0.43～0.47 g/L，總酸質(zhì)量濃度為3.73～5.52 g/L，pH在3.84～4.01水平，游離SO2和總SO2質(zhì)量濃度分別在17.10～19.90 mg/L和93.90～102.40 mg/L，以上指標(biāo)均符合國家GB/T 15037——2006的質(zhì)量規(guī)定。

表1 供試樣品的基本理化指標(biāo)Table 1 The basic physicochemical indexes of samples

注：表中同行不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 咖啡酸和迷迭香酸對赤霞珠干紅葡萄酒顏色的影響

2.2.1 CIELAB參數(shù)

試驗采用CIELAB系統(tǒng)對供試干紅葡萄酒的顏色情況進行了研究。由表2可知，發(fā)酵前添加酚類物質(zhì)處理的樣品其L*值降低了0.9～1.5 a.u.，使得處理酒樣具有較深的顏色狀態(tài)(P<0.05)。同時，樣品的a*值也反映出添加酚類物質(zhì)對酒體紅色色度的加強。與對照相比，咖啡酸和迷迭香酸處理樣品的a*值分別提高了1.0和1.3 a.u.，這一現(xiàn)象與先前的研究結(jié)論相似[7]。與a*值變化相反，各處理葡萄酒的b*值總體呈現(xiàn)下降的變化(2.3～4.2 a.u.)，表現(xiàn)出添加酚酸可有效減弱酒體黃化的效果(P<0.05)。一般認為，色素溶液中a*值的升高，以及L*和b*值的下降可能是輔色化過程中增色效應(yīng)和紅移變化的結(jié)果[23]。因此，這可能是導(dǎo)致處理樣品顏色提升的一種原因。另外，對比2個處理樣品發(fā)現(xiàn)，添加迷迭香酸樣品的b*值要遠低于咖啡酸樣品11.5%(P<0.05)，表現(xiàn)為更加有效減緩酒體黃化速度的效果。

表2 供試樣品顏色參數(shù)、不同類型花色苷比率以及總酚和總花色苷含量Table 2 The color parameters, ratio of different types of anthocyanins, and the content of total phenols and anthocyanins

注：-表示無

由表2可知，2個處理樣品的ΔEab*為2.5～2.7 a.u.。盡管ΔEab*在數(shù)值上<3.0，表明添加處理在此時還未能造成視覺上可辨別的顏色差異，但是結(jié)合上文中的其他顏色指標(biāo)，咖啡酸和迷迭香酸的處理仍對干紅葡萄酒的亮度和色調(diào)的改善產(chǎn)生影響。同時，比較添加兩酚類物質(zhì)的樣品，我們還發(fā)現(xiàn)迷迭香酸的作用效果要優(yōu)于咖啡酸處理，例如其L*值比后者低0.6 a.u.，a*和ΔEab*比后者高0.3和0.3 a.u.，呈現(xiàn)出較深的紅色狀態(tài)。而通過計算樣品的輔色花色苷比率可以看到，迷迭香酸樣品的CA%要顯著高于對照和咖啡酸樣品(87.7%和61.3%，P<0.05)，從而證實在顏色差異上的判斷。分析造成ΔEab*的原因可以看出，由色飽和度變化率(ΔC)和亮度變化率(ΔL)引起的顏色差異較為重要(ΔC+ΔL=85.6%～86.0%)(表2)。相比之下，由色調(diào)變化率(ΔH)引起的顏色差異表現(xiàn)出較弱的影響效果(<14.4%)。研究認為，ΔC和ΔL反映了ΔEab*的量變因素，而ΔH則主要與ΔEab*的質(zhì)變相關(guān)[24]。因此，添加酚類處理造成的溶液ΔEab*改變，可能與其量變因素有關(guān)。

2.2.2 總酚和總花色苷含量

酚類物質(zhì)的添加對樣品的總酚含量，特別是總花色苷含量有明顯的提升和穩(wěn)定作用[7]。陳釀起始時，各樣品總酚的平均含量為2 397 mg/L，經(jīng)過6個月的陳釀貯存后，雖然含量較試驗之初有所降低，但處理樣品其含量仍顯著高于對照(平均高出約580 mg/L)，與所加入的150 mg/L添加量比較，我們可以看到處理在發(fā)酵過程中加強多酚物質(zhì)浸出的效果；同時，咖啡酸和迷迭香酸的添加將促進輔色復(fù)合體的形成，并且上述物質(zhì)還可作為抗氧化劑進一步減少花色苷的氧化降解，降低陳釀期間花色苷的損失(處理較對照高出46.4～92.7 mg/L)，這可能是處理樣品顏色效果提升的原因之一。不過具體的花色苷變化情況還需要我們做進一步的分析。

2.2.3 花色苷的UHPLC-MS測定

利用UHPLC-MS方法在酒樣中可初步測定出5種單糖花色苷，10種酰化型花色苷和15種吡喃型花色苷(表3)。其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷及其衍生物在所檢測出的花色苷中含量最高，這與一些學(xué)者報道的有關(guān)歐亞種葡萄的色素含量特征相似[25]。比較樣品各花色苷類型含量可知，單糖苷及酰化型花色苷占比較高，分別是50.9%～51.0%和34.1%～44.1%(圖1)，而吡喃型花色苷盡管在種類數(shù)量上較優(yōu)(占總檢出數(shù)的50%，表3)，但是其含量卻相對有限(4.9%～14.0%)，考慮可能與較短的陳釀時間有關(guān)[22]。

圖1 供試樣品各類型花色苷含量Fig.1 The concentration of different types of anthocyanins注：同類型的不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

在5種單糖花色苷中，各樣品的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷分別為25.1 mg/L(對照組)、29.6 mg/L(咖啡酸)和32.9 mg/L(迷迭香酸)。可以看出，添加處理可有效穩(wěn)定二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量(處理較對照高出18.2%～31.4%)。同樣，其他4種單糖花色苷也不同程度地表現(xiàn)出處理對減少其含量降低的效果(5.9%～100.5%，除花青素和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷的咖啡酸處理)。研究發(fā)現(xiàn)，在紅葡萄酒陳釀過程中，單糖花色苷等游離態(tài)色素會發(fā)生降解、聚合、沉淀或與其他物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致其含量的下降[18]。而本試驗中單糖花色苷較高的保留量說明添加酚類處理對陳釀過程中花色苷有保護和穩(wěn)定作用，這與ALCALDE-EON等[26]的研究結(jié)果類似。

花色苷的糖分子上可酰化有機酸基團，形成較為穩(wěn)定的酰化型花色苷。常見的酰化基團主要為羥基肉桂酸類化合物。另外，乙酸、草酸、丙二酸、蘋果酸、琥珀酸也是較為常見的酰化分子[25]。供試樣品中共檢測到10種酰化型花色苷，分別是乙酰和香豆酰化合物。與單糖苷類花色苷呈現(xiàn)的趨勢相似，添加酚類物質(zhì)的樣品也在一定程度上出現(xiàn)了酰化型花色苷含量維持在較高水平的特點(咖啡酸和迷迭香酸處理較對照高出0.6%～81.0%)。特別是迷迭香酸處理，其二甲花翠素乙酰化-3-O-葡萄糖苷含量是對照的1.5倍，表現(xiàn)出明顯的差異(P<0.05)。

表3 供試樣品中花色苷質(zhì)量濃度 單位：mg/L

試驗還檢測到乙烯類、乙醛類、乙烯基苯酚類、乙烯基兒茶酚類、乙烯基愈創(chuàng)木酚類5種吡喃型花色苷。盡管其含量相對較低，但有研究顯示，游離態(tài)的花色苷在經(jīng)過吡喃化后可具有更強的顏色穩(wěn)定性[21]。例如，當(dāng)pH在1.0～5.0變化時，非吡喃化的游離態(tài)色苷色度會降低80%左右，而吡喃花色苷的色度卻沒有太大波動[25]。對比表3可知，處理樣品的吡喃型花色苷在質(zhì)量濃度方面沒有類似于前述花色苷的變化，其總質(zhì)量濃度分別是11.1 mg/L(對照組)、14.2 mg/L(咖啡酸)和5.7 mg/L(迷迭香酸)，考慮這可能與處理樣品較高的輔色化程度(13.4%～21.6%)，以及較短的貯藏時間有關(guān)。

2.3 咖啡酸和迷迭香酸對赤霞珠干紅葡萄酒香氣的影響

試驗采用頂空萃取和GC-MS技術(shù)對各酒樣香氣物質(zhì)進行了分析。由表4可知，共檢出74種香氣物質(zhì)，涉及酯類(31種)，醇類(20種)，酸類(11種)，萜烯類(8種)和醛類(4種)5種類型。

表4 供試樣品中香氣物質(zhì)含量 單位：μg/L

續(xù)表4

化合物閾值對照咖啡酸處理迷迭香酸處理香氣描述葉醇17.3±2.5b18.9±0.3b9.8±0.5a2,3-丁二醇1200022.2±3.5a34.6±6.3b44.4±1.8c黃油、乳酪正辛醇80032.8±1.2a72.9±1.8c38.6±2.7b茉莉香、檸檬味壬醇600126.6±4.7b88.8±0.0a126.9±1.6b水果、薔薇香癸醇50055.6±6.1b65.1±0.0c47.3±0.0a芐醇41301.9±3.9c127.9±9.5a218.2±6.1b苯乙醇110015356.5±130.4b19677.0±1.9c3482.9±71.2a玫瑰、花粉香異戊醇300009997.7±211.1b-3057.9±59.5a3-己烯-1-醇0.421.3±5.5a25.8±4.0b18.2±5.2a庚醇250030.9±3.7a27.9±4.8a-油膩味正丙醇50000-16.8±3.7b11.7±0.7a酒精味、成熟果香正丁醇--9.4±1.6小計32528.7±474.2c29051.1±162.6b11357.4±278.2a酸類乙酸2000061.3±13.2a159.3±78.5c105.7±25.2b醋酸味辛酸1000929.5±47.9b1318.9±167.7c369.6±185.1a奶油味丁酸25009.8±4.6a11.5±0.5a-癸酸30000126.5±4.8b453.3±57.7c54.9±8.5a酸腐味、脂肪味異丁酸42012.7±1.7b-7.3±1.8a黃油、乳酪、餿味2-甲基己酸50149.2±8.8--3-羥基月桂酸-27.8±5.0b6.3±1.9a庚酸-15.2±0.0-2-羥基肉豆蔻酸-3.4±0.6-反式-3-己烯酸--470.4±0.0異辛酸--13.2±4.5小計1289.0±80.9b1989.4±310.0c1027.4±226.9a萜烯類薄荷醇45.5±9.7--香茅醇40140.5±12.1c123.7±13.9b52.0±9.0a檸檬、柑橘香芳樟醇1530.7±2.4b26.9±3.2b18.0±2.7a玫瑰香、柑橘味γ-萜品醇16.5±1.3b33.7±3.7c9.4±3.4a反式-橙花叔醇70053.2±13.2b38.5±7.2a63.0±7.1c玫瑰、蘋果、青草味L-薄荷醇-27.7±1.1a37.1±3.7bβ-大馬士酮203.9±11.4a365.9±5.9c215.7±19.7b花香、果香、紫丁香香葉基丙酮60-57.1±7.1b29.9±1.9a青草味、果香味小計490.2±50.1b673.3±42.0c425.0±47.6a醛類苯甲醛210098.5±3.6b43.4±0.0a129.1±12.1c烘烤味、杏仁味壬醛-15.2±0.7b10.3±0.0a8.0±2.0a糠醛-35.4±2.0b37.4±0.0b17.6±8.0a癸醛1017.0±1.6a15.7±0.0a-香皂、橙皮味小計166.0±7.9b106.8±0.0a154.7±22.0b總計58734.1±525.6b59207.4±615.3b38922.2±458.9a

注：-表示樣品中未檢出該物質(zhì)；表中閾值來源于相關(guān)文獻[27-28]

酯類物質(zhì)是葡萄酒中最主要的一類揮發(fā)性物質(zhì)，其賦予葡萄酒濃郁的花香、果香。通常認為酯類物質(zhì)主要是由脂肪酸氧化、氨基酸代謝以及醇醛酯化等反應(yīng)途徑生成[27]。由表4可知，本試驗所測酒樣共檢出酯類物質(zhì)31種(對照25種、咖啡酸29種、迷迭香酸25種)。結(jié)合酯類物質(zhì)的香氣描述可知，乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙酯和月桂酸乙酯等表現(xiàn)果香、花香氣味的酯類物質(zhì)在各樣品中均具有較高含量水平(都高于各自對應(yīng)的閾值)，對葡萄酒的香氣有較大貢獻。但與對照相比，咖啡酸處理酒樣中的這些酯類物質(zhì)含量有所增加(14.2%)，表現(xiàn)出更加明顯的氣味特征，這與本實驗中的感官評價結(jié)果相一致(圖2)。而迷迭香酸處理酒樣卻與前者效果相異，盡管其全部酯類化合物總含量較對照樣品高出7.0%，但上述的酯類物質(zhì)卻呈現(xiàn)含量減少的現(xiàn)象(63.6%)，這一差異直接導(dǎo)致迷迭香酸處理樣品在感官評價中與咖啡酸的不同(圖2)。

葡萄酒中的醇類化合物主要由酵母細胞酒精發(fā)酵過程中的糖代謝以及由氨基酸脫羧、脫氫產(chǎn)生，也是葡萄酒香氣物質(zhì)的重要組成[28]。盡管處理樣品中正丙醇、正辛醇等具有花香、果香氣味的醇類含量有較大程度的增加(P<0.05)，但是處理酒樣的醇類物質(zhì)總量卻明顯降低(咖啡酸和迷迭香酸處理分別較對照降低了10.7%和65.1%)。從檢測到的16種醇類物質(zhì)含量來看，正戊醇、異戊醇、正己醇和苯乙醇等香氣化合物的含量相對較高(占醇類物質(zhì)總量的95.1%～98.0%)。其中具有草本植物和青草味的正己醇在處理樣品中的含量明顯降低(較對照降低了11.8%～18.1%)，考慮這將有助于弱化酒樣的生青感。同時，具有玫瑰樣氣味的苯乙醇在咖啡酸處理樣品中維持較高水平(是對照樣品含量的1.3倍)，這有可能在一定程度上提升其香氣的整體品質(zhì)。

葡萄酒中的脂肪酸類化合物來源于酵母菌和乳酸菌代謝的副產(chǎn)物。少量的酸類有助于改善葡萄酒的風(fēng)味，但其含量過高時則一般具有油脂、酸腐以及奶酪的氣息，會產(chǎn)生令人不愉快的感覺[28]。各試驗酒樣酸類化合物的種類數(shù)目無明顯差異，但經(jīng)咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣其酸類物質(zhì)總含量相較對照有顯著差別(P<0.05)。其中咖啡酸處理樣品中的酸類物質(zhì)含量增加了54.3%，而迷迭香酸處理卻降低了20.3%。例如，咖啡酸處理中辛酸(有奶油氣味)含量分別高于對照和迷迭香酸處理41.9%和256.8%，且超過閾值水平，考慮這將會對咖啡酸處理樣品帶來一定的負面影響。

萜烯類化合物作為葡萄酒的品種香氣，主要以鍵合態(tài)的形式存在，釀造過程可在糖苷酶的作用下將其轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)的香氣物質(zhì)，從而賦予葡萄酒濃郁的花香和果香[28]。試驗共定性出8種萜烯類化合物，其中咖啡酸處理可明顯提高酒中萜烯類化合物含量(較對照高出37.3%)，推測可賦予該處理葡萄酒樣品強烈的花香、果香，從而增強其酒體香氣的復(fù)雜性。此外，試驗還初步定性出4種醛類物質(zhì)，其中苯甲醛在迷迭香酸處理中含量相對較高(分別是對照和咖啡酸處理的1.3和2.9倍)，結(jié)合香氣描述，推測可賦予產(chǎn)品一定的烘烤和杏仁風(fēng)味。

2.4 感官品質(zhì)分析

對所有酒樣進行感官分析，各處理酒樣在余味長短和酒體方面得分無顯著性差異(圖2)。從顏色方面來看，咖啡酸和迷迭香酸處理的酒樣擁有較好的色度、色調(diào)特點。在香氣方面，咖啡酸處理的酒樣花香、果香較為突出，而迷迭香酸處理的樣品卻在酸度、甜度、花香、果香得分較低。

圖2 感官分析雷達圖Fig.2 Radar chart of sensory analysis

3 討論

本試驗中咖啡酸和迷迭香酸的添加提升了葡萄酒的整體顏色質(zhì)量以及總酚、總花色苷的含量。這主要是與咖啡酸和迷迭香酸作為輔色素同酒中花色苷發(fā)生輔色作用，促進酚類物質(zhì)浸提，保護花色苷的降解有關(guān)。酚類輔色素苯環(huán)中的共軛C=C雙鍵結(jié)構(gòu)，可以增強其與花色苷之間的π-電子離域，使得花色苷的吸收光譜發(fā)生變化，產(chǎn)生增色和紅移效應(yīng)[29]，考慮這可能是造成咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣具有較好顏色狀態(tài)的主要原因之一。另外，反應(yīng)體系中不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的輔色素將對花色苷的有色質(zhì)子化程度產(chǎn)生影響，抑制因水化和去質(zhì)子化反應(yīng)產(chǎn)生的無色化合物生成，形成不同的顏色效果[20]。觀察迷迭香酸的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，相比于咖啡酸，其結(jié)構(gòu)中含有2個多酚平面，且2個酚環(huán)之間有較長碳鏈，使其在與花色苷發(fā)生輔色作用時能夠更靈活的調(diào)整其空間構(gòu)象，這可能是造成迷迭香酸輔色能力較強的原因之一[23]。

試驗檢測出的各類花色苷中，咖啡酸和迷迭香酸處理酒樣的單糖花色苷比對照酒樣分別高出了11.8%和28.6%，酰化花色苷分別高出0.9%和49.9%。單糖花色苷是賦予新鮮葡萄酒色澤的主要成分，酚類物質(zhì)添加可促進發(fā)酵階段單糖花色苷的提取并降低其在陳釀期間的降解，這一結(jié)果與張波等[4]的研究結(jié)論一致。此外，酒樣中較高含量的酰化型花色苷可進一步提高花色苷的穩(wěn)定性，影響葡萄酒的陳釀潛能，改善葡萄酒的感官特性，使得樣品具有更好的顏色狀態(tài)[30]。因此，在陳釀過程中紅葡萄酒顏色的變化除可部分歸因于輔色作用對花色苷類物質(zhì)的穩(wěn)定效果外，酰化型花色苷較高的含量水平以及自身的穩(wěn)定特性也是導(dǎo)致其顏色增強的原因。

目前為止，酚類物質(zhì)是如何影響揮發(fā)性化合物的研究還鮮有報道。本研究中添加咖啡酸和迷迭香酸處理對赤霞珠葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量具有不同效果。其中，經(jīng)咖啡酸處理的酒樣香氣物質(zhì)種類和含量均有所增加，賦予樣品復(fù)雜的香氣特點，這與CHEN等[14]的研究結(jié)果相似，其認為酚類物質(zhì)可改變葡萄酒的香氣復(fù)雜性，防止顏色損失并增強葡萄酒的圓潤度。同時，試驗發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸處理酒樣的香氣化合物與對照相比減少了33.7%，造成這種差異的原因可能與咖啡酸和迷迭香酸分子本身的化學(xué)屬性有關(guān)，但這2種物質(zhì)與揮發(fā)性化合物之間具體的互作關(guān)系尚不清楚，因此酚類物質(zhì)對揮發(fā)性化合物的影響還需從機理上做進一步研究。

4 結(jié)論

發(fā)酵前添加150 mg/L咖啡酸和迷迭香酸處理均可增強赤霞珠干紅葡萄酒的顏色強度，顯著增加樣品中總酚和總花色苷含量，且迷迭香酸處理效果要優(yōu)于咖啡酸。

花色苷類物質(zhì)的UHPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，樣品中共有30種花色苷被檢出(包括5種單糖花色苷，10種酰化型花色苷和15種吡喃型花色苷)，供試樣品在各類花色苷物質(zhì)種類上無差異，但發(fā)酵前添加酚類物質(zhì)均可提高葡萄酒中花色苷的含量，特別是迷迭香酸處理后的酰化型花色苷。

香氣物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，咖啡酸處理提升了葡萄酒中酯類、酸類、萜烯類化合物的含量，降低了醇類和醛類化合物的濃度。迷迭香酸處理的葡萄酒中酯類化合物含量升高，但醇類、酸類、萜烯類和醛類卻有所降低。感官分析可知，咖啡酸處理提升了酒體香氣的復(fù)雜性，使其具有濃郁的花香、果香氣味和較低的生青感，而迷迭香酸處理的樣品卻在酸度、甜度、花香、果香方面表現(xiàn)較差。