一株海洋來源蛋白酶產生菌Parengyodontium album HX2019006的鑒定及其發酵條件研究

傅奇，林俊杰，莊峙廈，黃華斌，孫恩賢，甘美裕，肖玉娟

(廈門華廈學院，福建 廈門，361024)

蛋白酶是一種重要的工業用酶，廣泛應用于食品生產、畜牧養殖、皮革制造與環保產業。海洋微生物由于其生存環境與陸地微生物不同，在蛋白酶的結構、產酶能力和發酵條件等方面往往存在特殊性，是新蛋白酶生產菌種的重要來源。CHI等從青島市鹽湖地區的沉積物中分離出高產蛋白酶的酵母菌株Aureobasidiumpullulans[1]，ZHANG等在黃海的海洋細菌FlavobacteriumYS-80中發現了一種新的嗜冷海洋蛋白酶[2]，RAMESH等從孟加拉灣及其關聯水域篩選得到1株產高溫蛋白酶的鏈霉菌[3]，KUMAR等從韓國海灘篩選得到的1株BacillusClausii中分離得到了一種耐高溫堿性蛋白酶[4]。

課題組從廈門市紅樹林海泥中篩選得到1株產蛋白酶的絲狀真菌ParengyodontiumalbumHX2019006，可在海水培養基中發酵生產蛋白酶，其較優的蛋白酶發酵條件與報道的Parengyodontiumalbum產蛋白酶條件存在較大差異，具有進一步研究的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣本

分離菌株樣本為海泥，于廈門市集美區紅樹林退潮后，采集表層下5 cm左右泥層，置于4 ℃冷藏，1周內完成稀釋涂布[5]，使用前均質混勻。

1.1.2 培養基與試劑

2216E(液體)、2216E瓊脂，青島海博生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿粉，湖北安琪生物集團有限公司；海水晶，廣州益爾生物工程有限公司；酪蛋白、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、尿素、硫酸銨、FePO4，國藥集團化學試劑有限公司；真菌DNA提取試劑盒，北京全式金生物技術有限公司;ITS擴增引物ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 儀器與設備

Aerisbg096 PCR儀，新加坡ESCO公司；HE99核酸電泳儀，美國GE公司；211B搖床，上海蘇坤公司；LRH250生化培養箱，上海一恒公司；Quanta450掃描電鏡，LFEI公司；UV2450分光光度計，島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

取海泥25 g加入225 mL 2216E液體培養基均質，于外加3%(質量分數)葡萄糖和1%(質量分數)酪蛋白的2216E瓊脂平板稀釋涂布，30 ℃培養48 h，取有顯著水解圈的單菌落進行純化[6-7]。

1.2.2 細胞形態觀察

純化后的菌株劃線接種至加入3%葡萄糖的2216E瓊脂平板，將滅菌后的蓋玻片45°斜插在劃線路徑上，30 ℃培養48 h，取插片送至自然資源部第三海洋研究所科學儀器共享平臺，掃描電鏡觀察細胞形態。

1.2.3 菌種鑒定

用真菌基因組DNA抽提試劑盒，提取菌株的總DNA；用ITS引物擴增，所得PCR產物電泳純化后，由廈門鉑瑞生物科技有限公司測序。

ITS擴增條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min。

將測序結果在Genbank進行比對，選擇相似度較高的菌種序列，分別用BioEdit[8]和Clustal X[9]進行比對和編輯，取有效區間，采用最大簡約算法，用Paup*4.0構建進化樹[10-11]，選擇TrichodermadeliquescensGJS 89-129[12]作為外群。

1.2.4 發酵條件優化

種子培養基使用成品2216E液體培養基加入3%(質量分數)葡萄糖。

初始發酵培養基參考2216E培養基成分配制(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨5，酵母浸粉1，FePO40.01，海水晶30；用HCl/NaOH調節pH至7.5。

初始裝液量為250 mL錐形瓶中裝液50 mL，接種量10%，發酵時間72 h，發酵溫度30 ℃，搖床轉速100 r/min。

發酵液取離心后的上清液，按照GB/T 23527—2009蛋白酶制劑[13]中的福林法測定蛋白酶活力，以40 ℃、pH 7.5的條件下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需酶量為1 U[14]。

發酵條件先按照碳源種類、碳源濃度、氮源種類1(替代蛋白胨)、氮源濃度1(蛋白胨部分)、氮源種類2(替代酵母浸粉)、氮源濃度2(酵母浸粉部分)、FePO4濃度、海水晶濃度、初始pH、接種量、裝液量、發酵溫度、發酵時間的順序進行單因素逐步優化，再選擇單因素實驗中影響較大，且可能存在交互作用的因素用Design-Expert進行Box-Behnken響應面優化[15]。每組3個平行樣，取平均值進行分析，預實驗中搖床轉速>100 r/min時較易形成菌絲團，因此暫不考察搖床轉速對蛋白酶產量的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株分離純化

從海泥中篩選得到1株產蛋白酶絲狀菌，菌落白色、絨毛狀，產孢子，編號為HX2019006，細胞形態如圖1所示。

A-1 600倍;B-1 000倍圖1 HX2019006細胞掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of HX2019006 cells

2.2 菌種鑒定

HX2019006菌株ITS序列經測序拼接后，得到603 bp有效序列，于Genbank進行比對，與Parengyodontiumalbum(舊稱為Engyodontiumalbum[16]、Tritirachiumalbum[17])相似度最高，與多株Parengyodontiumalbum菌株相似度達99%以上。選擇相似度較高的菌株及相近屬代表菌株ITS序列構建進化樹如圖2所示。

樹長為380，一致性指數(consistency index,CI)為0.768，保留指數(retention index,RI)為0.819，同性指數(homoplasy index,HI)為0.232。各分枝自展值較高，樹形結構可靠，其中HX2019006菌株與Paren-gyodontiumalbum聚合在1枝，命名為Parengyo-dontiumalbumHX2019006。ITS序列上傳至Genbank，序列號為MN944461。

Parengyodontiumalbum是一種重要的新型蛋白酶產生菌，其產生的蛋白酶K可高效水解角蛋白[18]，也是核酸提取過程中常用的蛋白水解酶。SAMAL 等從ParengyodontiumalbumLimber菌株中分離得到多種新型蛋白酶[19]。CHELLAPPAN等從1株海洋來源的Parengyodontiumalbum菌株中分離得到1種新型堿性絲氨酸蛋白酶，具有高儲存穩定性，并耐受烴類、天然油脂、表面活性劑和多種有機溶劑[20]。對新菌株的蛋白酶和發酵條件進行分析具有重要的研究價值。

圖2 基于ITS序列的進化樹Fig.2 Phylogenetic trees based on ITS sequences

2.3 發酵條件優化

ParengyodontiumalbumHX2019006菌株在初始發酵條件下，蛋白酶產量為31.5 U/mL，單因素優化實驗結果如表1所示。

表1 發酵條件單因素優化試驗Table 1 Single factor optimization experiments of fermentation conditions

續表1

初始pH值pH5.56.57.58.59.5PA8.1(0.18)44.5(0.88)45.8(0.64)19.5(0.35)0(0.00)接種量比例2.0%6.0%10.0%14.0%18.0%PA26.1(0.41)40.4(0.94)45.4(0.53)45.9(1.09)42.5(0.69)裝液量培養基體積25mL50mL75mLPA47.6(1.44)46.1(1.11)43.8(0.65)培養溫度溫度26℃28℃30℃32℃34℃PA18.5(0.33)44.3(0.87)46.8(0.98)52.6(1.66)24.7(0.55)培養時間時間24h48h72h96h120hPA7.2(0.22)29.3(0.69)53.4(1.03)61.7(1.48)63.2(1.06)

注：PA為蛋白酶活力(protease activity)，括號內為標準差，加粗部分為該組實驗中綜合選擇的較優值

單因素優化實驗中一般取蛋白酶活力最高的試驗組開展后續實驗，但在優勢不顯著時，綜合成本與染菌風險選擇較優值。FePO4濃度對蛋白酶活力影響小，選擇不添加；接種量10%與14%差異不顯著，選擇較低接種量；裝液25 mL與50 mL差異不顯著，選擇較大裝液量；發酵96 h后酶活力增長較為緩慢，而染菌幾率較大，選擇96 h進行后續實驗。

優化后的培養基為(g/L)：麥芽糖20，蛋白胨7.5，酵母浸粉2，海水晶15，初始pH 7.5。接種量10%，250 mL三角瓶裝液50 mL，32 ℃培養96 h，蛋白酶活力達61.7 U/mL。其中麥芽糖濃度、蛋白胨濃度和培養時間對蛋白酶活力影響較大，且碳氮比、碳氮源量與培養時間之間可能存在交互作用[21-22]，因此，對這3個因素進行響應面優化，水平設置如表2所示。

表2 Box-Benhken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhken experiments

以麥芽糖濃度、蛋白胨濃度和培養時間為自變量，蛋白酶活力為因變量進行試驗，Box-Benhken試驗設計及結果如表3所示。

表3 Box-Benhken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Benhken experiments

注：括號內為標準差

二次回歸方程擬合得蛋白酶活力(Y)對麥芽糖濃度(A)、蛋白胨濃度(B)和培養時間(C)的編碼方程為Y=63.72+6.09A+12.38B+5.21C+3.87AB+2.5AC+4.33BC-6.41A2-11.49B2-6.41C2。模型方差分析如表4所示。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Variance analysis of regression model

由表4中可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P=0.642 0>0.05)，回歸模型的決定系數R2=0.999 2，校正系數R2=0.998 2,表明該模型與實驗結果擬合較好，適用于對ParengyodontiumalbumHX2019006菌株蛋白酶發酵試驗的分析與預測。各因素間的交互作用如圖3所示。

A-蛋白胨質量濃度與麥芽糖質量濃度交互作用；B-培養時間與麥芽糖濃度交互作用；C-培養時間與蛋白胨質量濃度交互作用圖3 三因素交互響應面Fig.3 Three-factor response surfaces

從圖3可知，在麥芽糖和蛋白胨供應充足時，適當延長培養時間可獲得較高的蛋白酶產量，根據回歸方程預測，較優條件為麥芽糖29.03 g/L，蛋白胨9.64 g/L，培養時間為116.92 h時，預計可獲得最高蛋白酶活力74.03 U/mL；為便于操作，按照麥芽糖29 g/L，蛋白胨9.6 g/L，培養時間117 h進行驗證，實際蛋白酶活力為72.8 U/mL，與預計值基本一致。

鑒于117 h發酵時間過長，發酵過程中染菌發生率較高(96 h為9.5%，120 h為19.0%)，發酵液揮發較嚴重(50 mL裝液量時，96 h平均揮發26%，120 h平均揮發34%)且周期過長。設置培養時間參數不超過96h時，方程預測較優條件為麥芽糖26.71 g/L，蛋白胨9.13 g/L，培養時間96 h時，預計可獲得最高蛋白酶活力為69.80 U/mL；為便于操作，按照麥芽糖26 g/L，蛋白胨9 g/L，培養時間為96 h進行驗證，實際蛋白酶活力為71.1 U/mL，綜合考慮，選擇此條件作為較優發酵條件，產酶量較響應面優化前提高15.2%，較最初培養條件提高了125.7%。

與該種的模式菌株ParengyodontiumalbumLimber產蛋白酶條件[23-24]相比，ParengyodontiumalbumHX2019006菌株產蛋白酶條件存在顯著差異，一是HX2019006菌株耐鹽，適于海水培養基生長，低鹽條件下生長緩慢且產酶較低；二是較優發酵條件存在顯著差異，除培養基組成差異外，HX2019006菌株較優發酵溫度為32 ℃，高于模式菌株28 ℃的發酵溫度。據報道，部分陸生Parengyodontiumalbum菌株可感染人體[25]，海洋來源的HX2019006菌株在低鹽濃度下生長緩慢，具有較高的生物安全性；同時，較高的發酵溫度有助于縮短發酵周期、減少發酵過程中降溫能耗等[26]，ParengyodontiumalbumHX2019006作為蛋白酶生產菌具有進一步研究價值。

3 結論

從廈門市集美區海泥中篩選得到1株產蛋白酶的絲狀真菌HX2019006，菌絲細小，產孢子。經提取ITS序列進行比對與建樹，鑒定為ParengyodontiumalbumHX2019006。該菌株在海水培養基中可發酵產生蛋白酶，經單因素與響應面優化，其較優發酵培養基為麥芽糖26 g/L，蛋白胨9 g/L，酵母浸粉2 g/L，海水晶15 g/L，初始pH 7.5；較優發酵條件為接種量10%，250 mL三角瓶裝液50 mL，32 ℃培養96 h；蛋白酶活力可達71.1 U/mL。該菌株與模式菌株ParengyodontiumalbumLimber生長及產蛋白酶條件存在存在顯著差異，具有進一步研究的價值。