甘草素調(diào)控WIG-1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及放療敏感性影響的研究

王 勇 黃大兵 沈夏波 張鋒利 張洪波

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)腫瘤科，合肥 230001)

肺癌是臨床常見惡性腫瘤且具有較高的發(fā)病率及死亡率，資料顯示，非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率呈增加趨勢(shì)且嚴(yán)重影響患者生命安全[1]。目前臨床不斷優(yōu)化放化療方案，肺癌相關(guān)靶向藥物及免疫治療可有效提高治療效果，但存在腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療耐受性等問題[2]。因而探究肺癌放療抵抗性的機(jī)制并尋找提高肺癌細(xì)胞放療敏感性的藥物有助于制定個(gè)性化治療方案。甘草素(liquiritigenin，LQ)是從甘草中提取的化合物，具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)活性，可增強(qiáng)不同腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性，提高治療效果及改善患者預(yù)后[3,4]。但LQ對(duì)肺癌細(xì)胞放療抵抗性的作用效果及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。野生型p53誘導(dǎo)基因1(wild-type p53-induced gene1，WIG-1)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)并可能參與細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)WIG-1基因在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞株中呈高表達(dá)并可能降低肺癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性[6]。本研究通過使用適宜濃度LQ作用于肺癌細(xì)胞，檢測(cè)放射線對(duì)肺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探討LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療敏感性，為肺癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細(xì)胞株H1299購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫；LQ購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院(純度99.68%)，置于DMSO中儲(chǔ)存；RPMI1640 培養(yǎng)基與胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán) (MTT)與Annexin-V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；兔抗人WIG-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cellsignal公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔IgG二抗與兔抗人GAPDH均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；BCA蛋白定量試劑盒與蛋白提取試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；WIG-1 siRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒均購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 H1299細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中培養(yǎng)，放入相對(duì)濕度95%、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，2 d更換培養(yǎng)液，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前1 d將H1299細(xì)胞重懸于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%左右時(shí)，分別將WIG-1 siRNA(si-WIG-1組)及陰性對(duì)照序列(si-con組)轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞，將pcDNA-WIG1(pcDNA-WIG1組)及pcDNA(pcDNA組)轉(zhuǎn)染至H1299細(xì)胞，將未進(jìn)行任何處理的H1299細(xì)胞作為NC組。轉(zhuǎn)染后放入恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2LQ處理及實(shí)驗(yàn)分組 收集未經(jīng)任何處理的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約H1299細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/ml)，180 μl/孔接種至96孔板，每孔加入20 μl不同濃度LQ溶液(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L)[7]，以未加入LQ溶液的H1299細(xì)胞為對(duì)照，對(duì)照H1299細(xì)胞中加入等體積生理鹽水培養(yǎng)，每組均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。采用X射線分別以劑量2、4、6、8 Gy照射H1299細(xì)胞，照射2次，3 min/次，將H1299細(xì)胞分別設(shè)為NC 組：只加培養(yǎng)基；DMSO組：陰性對(duì)照；LQ組：含有LQ的培養(yǎng)基。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中又分為放射組(IR組)：每次采用4 Gy X射線照射3 h；si-WIG-1+IR聯(lián)合放射組：將轉(zhuǎn)染si-WIG-1的H1299細(xì)胞經(jīng)4 Gy X線照射；LQ+IR聯(lián)合放射組：LQ處理H1299細(xì)胞12 h后采用4 Gy X射線照射；LQ+pcDNA+IR組：將pcDNA轉(zhuǎn)染至LQ+IR聯(lián)合放射組H1299細(xì)胞；LQ+ pcDNA-WIG1+IR組：將pcDNA-WIG1轉(zhuǎn)染至LQ+IR聯(lián)合放射組H1299細(xì)胞。所有經(jīng)X射線照射處理組均于處理3 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別取各組H1299細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104ml-1，以每孔100 μl單細(xì)胞懸液接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，分別于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后在每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO(150 μl/孔)，微量振蕩器振蕩，10 min后置于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=[1-(藥物處理組/陰性對(duì)照組吸光度值)]×100%。

1.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞，PBS清洗，1 200 r/min離心5 min，離心半徑為6 cm，加入結(jié)合緩沖液(500 μl)懸浮細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC與PI，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組H1299細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western blot檢測(cè)WIG-1蛋白表達(dá) 采用預(yù)冷PBS洗滌各組H1299細(xì)胞，參照蛋白提取試劑盒提取總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，25 μl蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶封閉2 h，加入WIG-1(1∶200)、GAPDH(1∶800)抗體孵育過夜(4℃)，次日PBS清洗，加入IgG二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h后使用PBS清洗，ECL顯影并置于凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白條帶。

1.2.6克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，按照1.2.2分組及照射劑量將H1299細(xì)胞分別接種至不同培養(yǎng)瓶，X射線照射，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=照射后細(xì)胞克隆形成率/照射細(xì)胞克隆形成率，其中克隆形成率為克隆細(xì)胞數(shù)與接種細(xì)胞數(shù)的比值，參照單擊多靶模型擬合曲線計(jì)算照射后各組H1299細(xì)胞存活曲線，每組均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，

2 結(jié)果

2.1不同濃度的LQ對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與未加入LQ組相比，0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L LQ作用24 h、48 h、72 h時(shí)肺癌細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)，隨著增加，細(xì)胞增殖抑制率均呈升高趨勢(shì)，檢測(cè)不同濃度LQ作用48 h時(shí)肺癌細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示隨著LQ作用濃度的增加，肺癌細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性上升(P<0.05)，見圖1、表1。綜合LQ不同濃度下抑制肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的差異，兼顧后續(xù)放射增敏研究的開展(MTT檢測(cè))，綜合LQ不同濃度下抑制肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡的差異，兼顧后續(xù)放射增敏研究的開展(MTT檢測(cè))。本研究選用LQ 0.2 mmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明LQ可抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

2.2LQ增加肺癌細(xì)胞的放療敏感性 根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果選用LQ作用48 h時(shí) 0.2 mmol/L濃度作為干預(yù)劑量，以DMSO為陰性對(duì)照。隨著放射劑量的增加，NC組、DMSO組與LQ組肺癌細(xì)胞H1299存活分?jǐn)?shù)均逐漸降低(P<0.05)， NC組與DMSO組相比差異無顯著無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LQ組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)相較于NC組、DMSO組均顯著降低(P<0.05)，見圖2、表2，LQ組H1299細(xì)胞增敏比(SER)為1.27，表明LQ可增加H1299細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。照射劑量4 Gy時(shí)H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為0.5左右，因此后續(xù)研究中以4Gy劑量為照射劑量。

圖1 不同濃度的LQ對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effects of different concentrations of LQ on apoptosis of lung cancer cells

2.3LQ和X射線(4 Gy)對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LQ聯(lián)合X射線對(duì)H1299細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示LQ組IR組H1299細(xì)胞凋亡率均比DMSO組顯著升高(P<0.05)，LQ+IR組H1299細(xì)胞凋亡率均顯著高于LQ 組、IR組(P<0.05)，LQ 組與IR組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 見表3。

圖2 不同劑量X射線照射后肺癌細(xì)胞的存活曲線Fig.2 Survival curves of lung cancer cells after different irradiation dosesNote: *.P<0.05.

表2 DMSO和LQ組間單擊多靶模型參數(shù)

Tab.2 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model between group DMSO and LQ

GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERDMSO2.042.25 3.06 0.77 0.48 -LQ1.641.48 2.47 0.58 0.61 1.27

GroupsInhibitory rate(LQ 0 mmol/L)24 h48 h72 hApoptosis rateLQ 0 mmol/L0.00±0.000.00±0.000.00±0.005.54±0.83LQ 0.1 mmol/L7.32±0.711)15.06±1.291)27.49±2.631)11.08±1.051)LQ 0.2 mmol/L14.24±1.291)2)23.43±2.881)2)38.54±3.321)2)16.43±2.121)2)LQ 0.4 mmol/L47.26±4.181)2)3)59.56±5.571)2)3)68.22±5.131)2)3)25.26±2.251)2)3)LQ 0.8 mmol/L63.34±5.221)2)3)4)75.57±6.241)2)3)4)87.17±6.141)2)3)4)47.41±3.841)2)3)4)F240.614187.930214.517154.323P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with LQ 0 mmol/L group,1)P<0.05;compared with LQ 0.1 mmol/L group,2)P<0.05;compared with LQ 0.2 mmol/L group,3)P<0.05;compared with LQ 0.4 mmol/L group,4)P<0.05.

GroupsApoptosis rate(%)DMSO5.16±0.49LQ16.82±1.151)IR13.28±1.271)LQ+IR34.49±3.432)3)F122.939P0.000

Note：Compared with NC group,1)P<0.05;compared with LQ group,2)P<0.05;compared with IR group,3)P<0.05.

圖3 不同濃度LQ對(duì)肺癌細(xì)胞WIG-1的表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of LQ ON expression of WIG-1 in lung cancer cells

GroupsWIG-1 proteinLQ 0 mmol/L0.96±0.08LQ 0.1 mmol/L0.62±0.061)LQ 0.2 mmol/L0.44±0.041)2)LQ 0.4 mmol/L0.31±0.031)2)LQ 0.8 mmol/L0.16±0.021)2)3)F110.837P0.000

Note：Compared with LQ 0 mmol/L group,1)P<0.05;compared with LQ 0.1 mmol/L group,2)P<0.05;compared with LQ 0.2 mmol/L group,3)P<0.05.

結(jié)果表明LQ可促進(jìn)放療后H1299細(xì)胞凋亡。

2.4不同濃度的LQ對(duì)肺癌細(xì)胞WIG-1表達(dá)的影響 Western blot法檢測(cè)不同濃度LQ對(duì)H1299細(xì)胞中WIG-1蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示隨著LQ作用濃度增加WIG-1蛋白表達(dá)呈劑量低依賴性降低(P<0.05)，呈劑量依賴效應(yīng)，見圖3、表4。結(jié)果表明LQ可抑制H1299細(xì)胞WIG-1蛋白表達(dá)。

圖4 沉默WIG-1對(duì)肺癌細(xì)胞放療敏感性的影響Fig.4 Effects of silenced WIG-1 on radiosensitivity of lung cancer cellsNote: A.Expression of WIG-1 in lung cancer cells;B.Survival curves of lung cancer cells after different irradiation doses.*.P<0.05.

GroupsWIG-1 proteinNC0.82±0.08si-con0.75±0.08si-WIG-10.27±0.041)F56.021P0.000

Note：Compared with si-con group,*.P<0.05.

表6 si-con和si-WIG-1組間單擊多靶模型參數(shù)

Tab.6 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model between group si-con and si-WIG-1

GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERsi-con2.13 2.11 2.70 0.74 0.47 -si-WIG-11.43 0.95 1.95 0.42 0.70 1.49

2.5沉默WIG-1肺癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性和細(xì)胞凋亡的影響 采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默WIG-1表達(dá)，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后H1299細(xì)胞中WIG-1蛋白表達(dá)并驗(yàn)證WIG-1的沉默表達(dá)效率，結(jié)果顯示si-WIG-1組H1299細(xì)胞中WIG-1蛋白表達(dá)顯著低于NC組、si-con組(P<0.05)，見圖4A、表5。提示沉默WIG-1表達(dá)效率良好。不同放療劑量照射H1299細(xì)胞后，si-WIG-1組、NC組及si-con組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均明顯降低(P<0.05)，si-WIG-1組顯著低于NC組、si-con組(P<0.05)，si-WIG-1組H1299細(xì)胞增敏比(SER)為1.49，見圖4B、表6。說明沉默WIG-1表達(dá)可增加H1299細(xì)胞放療敏感性。采用流式細(xì)胞術(shù)觀察H1299細(xì)胞凋亡情況，與si-con組相比，si-WIG-1組與IR組H1299細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與si-WIG-1組、IR組相比，si-WIG-1+IR組H1299細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表7。表明沉默WIG-1基因可誘導(dǎo)放療后H1299細(xì)胞凋亡。

GroupsApoptosis rate(%)si-con5.42±0.62si-WIG-117.73±1.451)IR12.87±1.141)si-WIG-1+IR31.74±2.872)3)F122.741P0.000

Note：Compared with si-con group，1)P<0.05；compared with si-WIG-1 group，2)P<0.05；compared with IR group，3)P<0.05.

圖5 過表達(dá)WIG-1逆轉(zhuǎn)LQ對(duì)肺癌細(xì)胞的放療敏感性Fig.5 Overexpression of WIG-1 reverses radiosensitivity of LQ to lung cancer cellsNote:Compared with LQ+pcDNA group,*.P<0.05;compared with LQ group, #.P<0.05.

2.6過表達(dá)WIG-1逆轉(zhuǎn)LQ對(duì)肺癌細(xì)胞的放療敏感性 為了驗(yàn)證LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因表達(dá)而增加H1299細(xì)胞放療敏感性，通過構(gòu)建WIG-1過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至LQ+IR組H1299細(xì)胞，Western blot法驗(yàn)證WIG-1的過表達(dá)效率，結(jié)果顯示pcDNA-WIG-1組H1299細(xì)胞中WIG-1蛋白表達(dá)水平顯著高于NC組、pcDNA組(P<0.05)，見圖5A、表8。提示W(wǎng)IG-1的過表達(dá)效率良好。隨著照射劑量的增加LQ+pcDNA組與LQ+pcDNA-WIG1組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均逐漸降低(P<0.05)，LQ+ pcDNA-WIG1組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著高于LQ+pcDNA組，LQ+pcDNA-WIG1組H1299細(xì)胞增敏比(SER)為0.793，見圖5B、表9。表明 WIG1過表達(dá)可降低LQ對(duì)H1299細(xì)胞放療增敏作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H1299細(xì)胞凋亡率，與LQ+pcDNA+IR比較，LQ+pcDNA-WIG1+IR細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見表10。表明WIG1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)LQ促進(jìn)放療后H1299細(xì)胞凋亡的作用。

GroupsWIG-1 proteinNC0.80±0.09pcDNA0.81±0.11pcDNA-WIG-11.48±0.141)F34.349P0.001

Note：Compared with pcDNA group，1)P<0.05.

表9 四組間單擊多靶模型參數(shù)

Tab.9 Parameters of single-hit multi-target(SHMT)model among four groups

GroupsD0 (Gy)Dq (Gy)NSF2kSERDMSO2.041 2.249 3.010 0.757 0.490 -LQ1.639 1.482 2.470 0.579 0.610 1.24LQ+pcDNA1.724 0.955 1.740 0.480 0.580 -LQ+ pcDNAWIG12.174 1.592 2.080 0.653 0.460 0.793

GroupsApoptosis rate(%)DMSO+IR14.84±0.93LQ+IR35.25±1.971)LQ+pcDNA+IR34.24±1.91LQ+ pcDNA-WIG1+IR16.27±1.242)F148.936P0.000

Note：Compared with DMSO + IR group,1)P<0.05;compared with LQ + pcDNA + IR group,2)P<0.05.

3 討論

肺癌發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖、凋亡失衡密切相關(guān)，抗腫瘤藥物可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制腫瘤惡化進(jìn)程，同時(shí)還可影響腫瘤細(xì)胞放療敏感性[8]。放療是腫瘤治療的主要方法之一，其主要作用機(jī)理為輻射可通過激活p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[9,10]。中藥提取物對(duì)惡性腫瘤放療敏感性的影響成為腫瘤放射治療的重點(diǎn)研究，但目前關(guān)于LQ與肺癌細(xì)胞放療敏感性的關(guān)系研究結(jié)果較少，因此探究LQ與肺癌細(xì)胞放療敏感性的關(guān)系可豐富臨床放療方案。

LQ的主要成分中包含二氫黃酮類成分，可抑制結(jié)腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖，還可抑制靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移[11,12]。本研究結(jié)果顯示不同濃度LQ干預(yù)H1299細(xì)胞后可劑量依賴性抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示LQ可抑制肺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。既往研究顯示LQ可通過激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)而抑制黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲[13,14]。分析LQ抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促使細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能為促進(jìn)細(xì)胞活性氧生成、上調(diào)抑癌基因p53及促凋亡蛋白Bax表達(dá)并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。由此推測(cè)LQ可能通過激活線粒體凋亡途徑進(jìn)而促進(jìn)H1299細(xì)胞凋亡。張榮芳等[16]研究表明LQ可通過提高鼻咽癌細(xì)胞自噬水平進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞放療敏感性。進(jìn)一步探究LQ是否可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療敏感性，本研究結(jié)果顯示LQ處理H1299細(xì)胞后接受不同X射線照射劑量照射，隨著照射劑量的增加H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯降低，LQ處理組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯低于DMSO組、NC組，說明LQ處理組H1299細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性強(qiáng)于DMSO組、NC組H1299細(xì)胞。提示LQ處理后可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療敏感性并避免放療抵抗性的發(fā)生。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌H1299細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示LQ+IR組H1299細(xì)胞凋亡率均顯著高于LQ 組、IR組，LQ處理后接受放療的H1299細(xì)胞凋亡率明顯升高，說明LQ可提高H1299細(xì)胞對(duì)放療的敏感性并促進(jìn)H1299細(xì)胞凋亡。提示LQ可能通過促進(jìn)H1299細(xì)胞凋亡進(jìn)而提高H1299細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

WIG-1基因在小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平高于敏感細(xì)胞，抑制WIG-1基因表達(dá)可增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞敏感性[17]。WIG-1主要依賴p53發(fā)揮作用，正常生理?xiàng)l件下WIG-1呈低表達(dá)，WIG-1是p53直接作用靶點(diǎn)，機(jī)體受到刺激或創(chuàng)傷時(shí)WIG-1表達(dá)水平明顯升高并可參與細(xì)胞增殖及凋亡等多種生物學(xué)過程[18,19]。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)WIG-1基因高表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)可通過抑制ERCC1及P-gp表達(dá)進(jìn)而提高食管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[20]。WIG-1在小細(xì)胞肺癌與食管癌發(fā)生及發(fā)展過程中的表達(dá)及作用效果不同，其可能與癌細(xì)胞種類及作用通路不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示不同濃度LQ處理后均可抑制H1299細(xì)胞中WIG-1蛋白表達(dá)，隨著作用濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)。通過沉默WIG-1表達(dá)分析其對(duì)肺癌細(xì)胞放療敏感性及細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放療劑量照射H1299細(xì)胞后si-WIG-1組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著低于NC組、si-con組，說明沉默WIG-1表達(dá)可增強(qiáng)H1299細(xì)胞放療敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示si-WIG-1+IR組H1299細(xì)胞凋亡率顯著高于si-WIG-1組、IR組，說明沉默WIG-1表達(dá)后經(jīng)X射線照射可促進(jìn)H1299細(xì)胞凋亡。提示沉默WIG-1可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞放療敏感性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為證實(shí)LQ是否通過調(diào)控WIG-1基因發(fā)揮作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)pcDNA-WIG1組H1299細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著高于LQ+pcDNA組，且增敏比明顯降低，說明WIG1過表達(dá)后可降低H1299細(xì)胞放療敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示LQ+ pcDNA-WIG1+IR組H1299細(xì)胞凋亡率顯著低于LQ+pcDNA+IR組，說明WIG1過表達(dá)與LQ共同處理H1299細(xì)胞后經(jīng)照射細(xì)胞凋亡率明顯升高。提示過表達(dá)WIG-1可逆轉(zhuǎn)LQ對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡及放療敏感性的作用。

綜上所述，LQ可促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)可通過調(diào)控WIG1基因表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，為臨床治療研究提供理論依據(jù)。但仍需通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床檢測(cè)驗(yàn)證LQ對(duì)肺癌發(fā)生及發(fā)展的作用。