支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌檢測聯(lián)合T-SPOT.TB 試驗診斷菌陰肺結(jié)核的價值研究

陳廷憲 黃祖軍 陳勇毅

培養(yǎng)法診斷結(jié)核具有較長時間周期，并且陽性率一直不高，在肺結(jié)核的診斷上顯得相對遲緩。近年來，分子生物學(xué)得到了迅速的發(fā)展，核酸擴(kuò)增等技術(shù)也在結(jié)核的診斷中得以應(yīng)用，但因種種缺陷的存在，其靈敏度、特異性也不是十分理想，因此，采取有效措施，更加快捷、準(zhǔn)確、有效地診斷結(jié)核病，顯得十分重要。本研究前瞻性擬選取本院2018 年12 月—2019 年12 月收治的菌陰肺結(jié)核患者60 例作為研究組，另選取非結(jié)核性疾病患者60 例非結(jié)核受試者作對照組，均進(jìn)行支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）結(jié)核桿菌檢測及T 細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點試驗（T-SPOT.TB），分析支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌檢測聯(lián)合T-SPOT.TB 試驗診斷菌陰肺結(jié)核的臨床價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2018 年12 月—2019 年12 月收治的菌陰肺結(jié)核患者60 例作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)：抗結(jié)核治療有效；以發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等非特異性癥狀就診，無典型肺結(jié)核表現(xiàn)，干咳無痰或痰涂片抗酸染色陰性，快速培養(yǎng)無結(jié)核菌生長。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：排除其他非結(jié)核疾病。所有患者支氣管鏡檢查前涂片找抗酸桿菌3 次陰性，1 次培養(yǎng)陰性。另選取非結(jié)核性疾病患者60 例非結(jié)核受試者作對照組。對照組中，女性17 例（28.33%）、男性43 例（71.67%）；年齡17 ～76 歲，平均年齡（52.15±13.41）歲。研究組中，女性15 例（25.00%）、男性45 例（75.00%）；年齡16 ～76 歲，平均年齡（51.62±11.57）歲。兩組一般資料對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

1.2 方法

所有研究對象均進(jìn)行BALF結(jié)核桿菌檢測及T-SPOT.TB試驗。比較T-SPOT.TB 試驗及支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌檢測單獨使用及聯(lián)合檢測時診斷敏感度、特異度、診斷效率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。（1）T-SPOT.TB 試驗：采用酶聯(lián)免疫斑點試驗，使用結(jié)核感染T 細(xì)胞檢測試劑盒，依照說明進(jìn)行操作，分離制備人外周血單個核細(xì)胞，制成工作濃度細(xì)胞懸液，并連同抗原一同加至微孔培養(yǎng)板，在37.0℃和5%CO2培養(yǎng)環(huán)境下過夜，洗滌培養(yǎng)板并且滴加酶標(biāo)抗體，再洗滌培養(yǎng)板后滴加底物反應(yīng)液，進(jìn)行SPOT計數(shù)，依照抗原A 或/和抗原B 孔反應(yīng)情況，對結(jié)果作出判斷：當(dāng)陰性對照孔SPOT 數(shù)在0 ～5 之間時，陽性樣本應(yīng)為：（抗原A或抗原B 的SPOT 數(shù)）-（陰性對照孔SPOT 數(shù)）≥6；當(dāng)陰性對照孔SPOT 數(shù)等于或超過6 時，陽性樣本應(yīng)為：（抗原A 或抗原B 的SPOT 數(shù)）≥2×（陰性對照孔SPOT 數(shù)）。（2）BALF 結(jié)核桿菌檢測：根據(jù)患者病變部位對灌洗肺段加以選擇，插入纖維支氣管鏡頂端至選好的肺段或亞段支氣管開口位置，由活檢孔給予2%利多卡因2 ～3 mL，局麻后再行注入37.0℃的生理鹽水，共注入10 ～20 mL 生理鹽水，注入完畢后立即吸引并回收BALF，可重復(fù)進(jìn)行2 ～3 次并共收集15 mL 灌洗液。①BALF 涂片，采用萋-尼氏抗酸染色法，找到≥3 個抗酸桿菌/300 視野即判斷為陽性；②使用羅氏固體培養(yǎng)法進(jìn)行BALF 結(jié)核菌分離培養(yǎng)。③應(yīng)用實時熒光定量核酸擴(kuò)增（Xpert MTB/RIF）法檢測灌洗液中結(jié)核分枝桿菌DNA。

1.3 觀察指標(biāo)

比較T-SPOT.TB 試驗 及支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌檢測單獨使用及聯(lián)合檢測時診斷敏感度（即真陽性率）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以例（%）表示計數(shù)資料，采用χ2檢驗，以（）表示計量資料，采用t 檢驗，并P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

60 例菌陰肺結(jié)核患者中，抗酸桿菌涂片陽性11 例，陽性率18.33%；結(jié)核菌培養(yǎng)（羅氏法）陽性31 例，陽性率51.67%；肺泡灌洗液TB-DNA 陽性49 例，陽性率81.67%，TB-DNA 陰性11 例中，4 例結(jié)核菌培養(yǎng)或抗酸桿菌涂片陽性。灌洗液抗酸桿菌涂片、培養(yǎng)、TB-DNA 三項聯(lián)合檢測，病原學(xué)總陽性率（49+4）/60=88.33%。60 例菌陰肺結(jié)核患者中，T-SPOT 陽性59 例，陽性率98.33%，T-SPOT 陰性1 例，陰性率1.67%。60 例非結(jié)核性疾病患者中，T-SPOT 陽性3 例（5.00%），陰性57 例（95.00%）。研究組T-SPOT 陽性率明顯高于對照組（P ＜0.01）。T-SPOT.TB試驗及支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌聯(lián)合檢測提高了診斷敏感度，詳見表1、表2。

3 討論

肺結(jié)核曾經(jīng)嚴(yán)重危害我國人民群眾，且近年來耐藥菌的問題日益嚴(yán)重。涂陽肺結(jié)核大約僅為發(fā)病例數(shù)的50%，菌陰肺結(jié)核的人數(shù)逐漸上升，給臨床早期確診和及時有效治療造成了一定的困擾[1-2]。近年來，分子生物學(xué)取得飛速的發(fā)展，核酸擴(kuò)增等技術(shù)的發(fā)展也很快，并且已經(jīng)在結(jié)核診斷中有了一定的應(yīng)用，但目前僅靠該類實驗方法還難以達(dá)到很高的檢測靈敏度和特異性[3-4]。

支氣管鏡檢查作為一種輔助診斷肺結(jié)核的重要手段，能夠直接獲取細(xì)菌學(xué)依據(jù)，通過BALF 直接在病灶支氣管肺泡內(nèi)取材，使得檢出結(jié)核分枝桿菌的機(jī)會增加，即使無痰的病例也可藉此進(jìn)行檢測[5-6]。T-SPOT.TB 試驗是一種依靠特異性抗原，以酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)對結(jié)核進(jìn)行診斷的新技術(shù)，資料顯示其敏感性及特異性較高，它不會受到環(huán)境分枝桿菌或卡介苗接種的影響，并且受到患者免疫抑制的影響很小，即使HIV 感染的患者也依然適用，且其操作方法簡便，檢測周期較短，24 h 之內(nèi)一般可獲得檢測報告，因此在臨床上日益得到廣泛的應(yīng)用，在各類肺結(jié)核患者中均有應(yīng)用[7-8]。因為支氣管鏡檢查在臨床上的應(yīng)用非常廣泛，因而對于肺結(jié)核的診斷，也提供了極有價值的參考[9-12]。結(jié)合通過電子支氣管檢查獲得BALF，再通過相應(yīng)方法來進(jìn)行核酸檢測，可使診斷的陽性率得到進(jìn)一步提高，如廖明等[13]選擇86 例疑似肺結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT.TB、BALF-TbDNA、BALF 涂片、痰涂片、PPD、結(jié)核抗體檢測，并對于T-SPOT.TB 與BALF-TbDNA 聯(lián)合檢測與單用檢測、涂片法、PPD、結(jié)核抗體檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析，結(jié)果血T-SPOT.TB、BALF-TbDNA 敏感性分別為84.8%、80.4%，特異性分別為80.0%、77.5%，兩者聯(lián)合檢測敏感性達(dá)到100.0%，陽性預(yù)測值達(dá)97.1%，陰性預(yù)測值達(dá)100.0%，均優(yōu)于單用檢測（P ＜0.05），50 例肺結(jié)節(jié)病和123 例肺結(jié)核患者進(jìn)行T-SPOT 和肺泡灌洗液T細(xì)胞亞群檢測，結(jié)果肺結(jié)節(jié)病患者中T-SPOT 陽性率為4.0%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞百分比分別為（88.79±5.34）、（63.58±20.56）、（27.42±6.76）%，CD4+/CD8+比值為（2.32±2.00）；肺結(jié)核患者中T-SPOT 陽性率為90.2%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞百分比分別為（75.10±11.20）、（44.52±7.30）、（32.10±12.30）%，CD4+/CD8+比值為（1.30±1.20）。肺結(jié)節(jié)病患者較肺結(jié)核患者CD3+和CD4+T 細(xì)胞明顯增多，CD4+/CD8+比值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），CD8+T 細(xì)胞有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；肺結(jié)核患者T-SPOT 陽性率明顯高于肺結(jié)節(jié)病患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。

表1 各檢查方法在各組中的結(jié)果（例）

表2 各檢查方法在60 例菌陰肺結(jié)核患者中的診斷敏感度對比 [例（%）]

本文則探討了支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌檢測（同時行抗酸桿菌涂片、培養(yǎng)、核酸檢測）聯(lián)合T-SPOT.TB 試驗診斷菌陰肺結(jié)核的價值，以期提高痰涂片及培養(yǎng)陰性的肺結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢出率，為菌陰肺結(jié)核的診斷提供依據(jù)。結(jié)果表明，聯(lián)合檢測較上述單獨檢查的診斷敏感度有顯著提升（P＜0.01）。

綜上所述，T-SPOT.TB 試驗及支氣管肺泡灌洗液結(jié)核桿菌聯(lián)合檢測提高了診斷敏感度，值得進(jìn)一步研究、推廣。