鋅摻雜碳點聯合藍光照射對金黃色葡萄球菌生長及其生物膜形成的抑制作用

劉東寧，楊明錫，劉歆嬋，李 艷，武 洲，于維先

(1.吉林大學口腔醫院牙周科，吉林 長春130021；2.吉林大學超分子結構與材料國家重點實驗室，吉林 長春130012；3.吉林大學口腔醫院老年口腔科，吉林 長春130021；4. 日本九州大學大學院 齒學研究院，日本 福岡812-8581；5. 吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春130021)

細菌感染常導致許多嚴重疾病的發生，其中金黃色葡萄球菌是常見的致病菌之一，給社會帶來了巨大的公共衛生負擔。而病原菌對抗生素耐藥性的增加，使金黃色葡萄球菌的有效防治更加困難。細菌生物膜的形成及其難以清除是導致細菌耐藥和引起持續性感染的主要原因之一，這推動了對抗菌策略的探索，如納米技術、光動力抗菌療法(antimicrobial photodynamic therapy, APDT)和微電技術等[1]。光動力療法(photodynamic therapy, PDT)是治療癌癥特別是皮膚癌的手段之一。近年來，PDT被應用于治療包括細菌在內的多種感染性疾病，并被命名為APDT[2]。研究[3-4]顯示：APDT機制為激光激發光敏劑產生的活性氧作用于細胞膜，從而破壞生物膜結構及其他功能單位引起微生物死亡或凋亡，這種抗菌機制使細菌不易產生耐藥性。

研究[5]顯示：碳點(carbon dots, CDs)又稱碳納米點，是一種類量子點狀納米材料，其光學性質及光催化功能類似于傳統納米半導體[6-7]，CDs不僅可產生熒光發射[8- 9]，還可以驅動各種催化過程，具有較強光動力效應[10]，這些特性使CDs作為APDT光敏劑具有較好的應用前景。LIU等[11]以甲硝唑為前體合成熒光CDs，明確了其對牙齦卟啉單胞菌具有選擇性抗菌活性。KUMARI等[12]合成了由CDs、原卟啉Ⅸ(PpⅨ)和DNA組成的雜交水凝膠，發現CDs能量轉移對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)有殺傷作用；KOVCOV等[13]合成CDs復合材料發現：藍光照射時間達到60 min時其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長有抑制作用。上述研究雖明確了CDs的抗菌性能但同時體現出其不足，例如細胞毒性大、制備方法復雜、原材料不易獲得和光照時間過長等。本實驗以檸檬酸、乙二胺和醋酸鋅為碳源通過簡單、綠色的水熱法制備了水溶性好、無毒及光穩定性好的鋅摻雜CDs，在藍光激發CDs的條件下，明確其對金黃色葡萄球菌及其生物膜形成的抑制作用，并初步探討相關機制，以期為鋅摻雜CDs在該領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

小鼠成纖維細胞系L929和小鼠前成骨細胞系MC3T3-E1(中科院細胞庫)。H-DMEM培養基、胎牛血清和青-鏈霉素雙抗(美國Gibco公司)，細胞增殖-毒性檢測試劑盒CCK-8(日本Dojindo公司)，LB培養基(青島科技園海博生物公司)，金黃色葡萄球菌ATCC25923為吉林大學口腔醫院實驗室保存菌株，結晶紫染料(珠海迪爾生物工程有限公司)，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)(上海碧云天生物技術有限公司)，醋酸鋅(北京化學試劑)。LED藍光燈(波長400～500 nm,15 W,中山市邁能照明科技有限公司)，CO2恒溫細胞培養箱(日本SANYO公司)，臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，馬弗爐(型號JKKZ4-10,濟南精密科學儀器儀表有限公司)，透射電子顯微鏡(TEM)(型號JEM-2100F,日本電子株式會社)，傅立葉紅外光譜儀(FT-IR)(型號AVATAR360,美國Nicolet Instrument公司)，熒光光譜儀(型號RF-5301PC,日本島津公司)，酶標檢測儀(美國Bio-TEK公司)。

1.2 CDs的制備

取5 mmol·L-1檸檬酸、5 mmol·L-1乙二胺和2 mmol·L-1醋酸鋅，溶解于10 mL去離子水中,攪拌均勻后,移入10 mL反應釜中，在200℃條件下于馬弗爐中反應6 h，待反應釜冷卻至室溫后，將反應釜中液體用0.22 μm濾器過濾，經PBS滲析48 h，滲析液每6 h更換1次，獲得CDs樣本待后續實驗。

1.3 CDs的表征

1.3.1 TEM檢測CDs形態、粒徑和分布 取1 mL CDs溶液，采用9 mL去離子水稀釋后，取10 μL滴加在直徑為3 mm的V3超薄碳網上，待晾干后，觀察CDs形態，采用Nano Measurer軟件計算CDs粒徑大小和分布。

1.3.2 CDs熒光光譜儀檢測 取0.5 mL CDs溶液于石英比色皿中，稀釋至有效測定濃度，熒光發射光譜的掃描范圍設置為220 ～750 nm，狹縫寬度為5 nm，掃描速度為2 000 nm·min-1，掃描獲得CDs的熒光光譜。

1.3.3 FT-IR檢測 取適量溴化鉀粉末于瑪瑙研缽中，加入1滴CDs溶液，待烘干后快速研磨成粉末，采用模具加壓形成均勻透明薄片，進行紅外光譜測試( 400～4 000 cm-1波段)，通過傅立葉變換獲得CDs的FT-IR光譜。

1.4 各組細胞增殖率檢測

采用CCK-8法檢測CDs的細胞毒性，實驗分為空白對照組和CDs組，分別取對數生長期L929和MC3T3-E1細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種至96孔板，于37 ℃、5%CO2孵育箱中培養24 h，然后換更為含有不同濃度 (50、75和100 mg·L-1)CDs的培養液，空白對照組僅加入細胞培養液，繼續培養24 h。采用PBS洗滌各孔，加入含有10 μ L CCK-8的培養液100 μL，孵育2 h，酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=(實驗組A值/空白對照組A值)×100%。

1.5 各組菌液濃度檢測

采菌液制備：采用滅菌環挑取金黃色葡萄球菌單個菌落，接種于LB培養液，37 ℃孵育18～24 h后，將上述菌液于600 nm波長處測定A值，使A(600)=0.5時，相應菌種濃度為1×108CFU·mL-1,按1∶100稀釋后待用。實驗分為空白對照組、單獨CDs溶液組、單獨藍光照射組和CDs+藍光照射組。單獨CDs溶液組：CDs溶液用LB培養液稀釋至100、150和200 mg·L-1待用,取100 μL實驗菌液于96孔板中，分別加入100 μL(50、75和100 mg·L-1)CDs溶液，搖勻；單獨藍光照射組：照射時間為10、20和40 min。取100 μL實驗菌液于96孔板，每孔再加入100 μL LB培養液，搖勻，采用藍光進行照射，為使樣本光照均勻，燈與樣本間距離為50 cm；CDs+藍光照射組：取100 μL實驗菌液于96孔板，分別加入100 μL上述CDs溶液，搖勻，藍光分別照射10、20和40 min；空白對照組：取100 μL實驗菌液于96孔板，僅加入100 μL培養液，搖勻。以上各組菌液避光培養24 h,于波長600 nm處測得A值，以A(600)值代表菌液濃度。

1.6 各組金黃色葡萄球菌生物膜形成量檢測

采用96孔板結晶紫染色法，分組同1.5。將培養24 h的成熟生物膜采用PBS洗滌2次，加入甲醇固定，而后加入0.1%結晶紫溶液染色15 min,棄去染色液，PBS洗滌3次，干燥，最后加入95%乙醇溶解，于波長590 nm處測定A值，以A(590)值代表各組金黃色葡萄球菌生物膜形成量。

1.7 加入NAC后各組菌液濃度、金黃色葡萄球菌生物膜形成量檢測和菌落計數

觀察加入活性氧清除劑NAC和藍光照射40 min后，100 mg·L-1CDs溶液中金黃色葡萄球菌生長情況及生物膜形成量。實驗采用快速分光光度法、平板菌落計數法和結晶紫染色法檢測。快速分光光度法：實驗分為對照組、100 mg·L-1CDs組、0.5 mmol·L-1NAC組和0.5 mmol·L-1NAC + 100 mg·L-1CDs組，實驗步驟同1.5。平板法：取無菌試管4支，分別加入實驗菌液0.5 mL，第1管加入0.5 mL培養液，第2管加入0.5 mL上述CDs溶液，第3管加入0.5 mL CDs溶液后加入0.5 mmol·L-1NAC，第4管加入0.5 mL培養液后加入0.5 mmol·L-1NAC，混勻，藍光照射40 min，避光培養。24 h后在各試管中取出0.3 mL按1∶100稀釋后取20 μL均勻涂布于固體LB培養平板并標記，培養24 h，觀察菌落生長情況，記錄菌落計數。結晶紫染色法：分組同上，實驗步驟同1.6。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 CDs形態、粒徑和分布

在TEM下制備的CDs為均勻分布的球形納米顆粒，在高分辨TEM ( HRTEM)下CDs不具有明顯的晶格結構，為無定型狀態,見圖1。Nano Measurer軟件統計50個CDs粒徑顯示：CDs粒徑為1.4～2.6 nm，平均粒徑為1.8 nm，CDs粒徑及分布見圖2。

圖1 TEM(A)和HRTEM(B) 下CDs形態表現(Bar=60 nm)

Fig.1 Morphology of CDs under TEM(A) and HRTEM(B)(Bar=50 nm)

圖2 CDs粒徑和分布

2.2 CDs熒光光譜

最佳激發波長為342 nm，最佳發射波長為440 nm，此外CDs具有隨激發波長而改變發射波長的性質，即激發依賴性。CDs熒光光譜見圖3(插頁六)。

2.3 CDs的FT-IR光譜

CDs表面具有羥基、羧基、氨基和環氧基團等官能團，3 500 cm-1附近的寬峰為締合OH的伸縮振動吸收峰，1 700 cm-1附近為C=O雙鍵伸縮振動峰,1 500 cm-1附近為N-H伸縮振動峰，3 000 cm-1附近和1 400 cm-1附近為C-H伸縮振動吸收峰，1 200 cm-1附近為C-NH-C伸縮振動吸收峰，1 000 cm-1附近為C-O-C的對稱伸縮振動峰，這些基團賦予了CDs良好的穩定性和水溶性。CDs的FT-IR光譜見圖4。

圖4 CDs的FT-IR光譜

2.4 各組細胞增殖率

當CDs與細胞共培養24 h后，隨著CDs濃度增加，細胞增殖率相應減少；100 mg·L-1CDs組 L929和MC3T3-E1細胞增殖率與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，L929細胞和MC3T3-E1細胞增殖率均達80%，表明CDs對細胞活性影響較小。見表1。

表1 各組L929和MC3T3-E1細胞增殖率

GroupProliferation rateL929 cellsMC3T3-E1 cellsBlank control100.001±0.368100.000±4.211CDs(mg·L-1 ) 50100.717±2.411104.125±6.142 7597.197±1.15188.806±5.260△ 10080.052±1.155**80.253±1.449*

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank control group.

2.5 各組金黃色葡萄球菌的菌液濃度

單獨CDs溶液組菌液濃度與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。藍光照射20 和40 min后，單獨藍光照射組菌液濃度與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，表明藍光照射20 min以上具有一定的抗菌效果。當藍光照時10 min時，CDs+藍光照射組菌液濃度明顯低于單獨藍光照射組(P<0.01)。當藍光照射40 min時，菌液濃度具有濃度依賴性，隨著CDs濃度的增加，菌液濃度降低，即抗菌效果更加明顯。當CDs濃度為100 mg·L-1時，抗菌效果具有光照時間依賴性，即隨著光照時間的增加，菌液濃度明顯降低。見表2。

表2 各組金黃色葡萄球菌的菌液濃度

GroupConcentration of S.aureusBlue light (0 min)Blue light (10 min)Blue light (20 min)Blue light (40 min)Blank control0.700±0.0260.636±0.0430.541±0.035*0.454±0.018**CDs(mg·L-1 ) 500.684±0.0290.309±0.007#0.262±0.027△0.241±0.022○ 750.682±0.0500.232±0.074△0.226±0.019#0.164±0.020○ 1000.609±0.0240.226±0.004△0.171±0.014#0.018±0.003○

*P<0.05,**P<0.01 compared with blank control group;△P<0.01 compared with blue light(10 min) group;#P<0.01 compared with blue light (20 min) group;○P<0.01 compared with blue ligth(40 min) group.

2.6 各組金黃色葡萄球菌生物膜形成量

單獨CDs溶液組金黃色葡萄球菌的生物膜形成量與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),CDs對金黃色葡萄球菌生物膜形成量無影響。與空白對照組比較，隨著藍光照射時間的增加,單獨藍光照射組金黃色葡萄球菌生物膜形成量相應減少，但藍光照射10和20 min時對金黃色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用較弱，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。當藍光照射40 min時，與空白對照組比較，金黃色葡萄球菌生物膜形成量減少(P<0.01)。當光照10、20和40 min時，與單獨藍光照射組比較，CDs+藍光照射組金黃色葡萄球菌生物膜形成量減少(P<0.01)。見表3。

2.7 加入NAC后各組菌液濃度、菌落計數和生物膜形成量

0.5 mmol·L-1NAC + 100 mg·L-1CDs組金黃色葡萄球菌菌液濃度明顯高于100 mg·L-1CDs組(P<0.01)，見圖5。平板菌落計數法檢測結果顯示：0.5 mmol·L-1NAC + 100 mg·L-1CDs組菌落計數高于100 mg·L-1CDs組(P<0.05)，見圖6和圖7(插頁六)。結晶紫染色結果顯示：0.5 mmol·L-1NAC + 100 mg·L-1CDs組金黃色葡萄球菌生物膜形成量明顯低于100 mg·L-1CDs組(P<0.01)。見圖8。

表3 各組金黃色葡萄球菌生物膜形成量

GroupBiofilm formation amount of S.aureusBlue light (0 min)Blue light (10 min)Blue light (20 min)Blue light (40 min)Blank control2.990±0.0872.644±0.2412.403±0.0922.043±0.288*CDs(mg·L-1 ) 502.737±0.6041.300±0.367△0.956±0.111#0.685±0.029△○ 753.106±0.0490.716±0.038△0.783±0.034△#0.651±0.053△○ 1002.623±0.2450.802±0.096△0.534±0.024△#0.227±0.024△○

*P<0.01 compared with blank control group;△P<0.01 compared with blue light (10 min)group;#P<0.01 compared with blue light (20 min) group;○P<0.01 compared with blue ligth(40 min) group.

1:Control group;2:100 mg·L-1CDs group;3:0.5 mmol·L-1NAC+100 mg·L-1CDs group;4:0.5 mmol·L-1NAC group.*P<0.01 compared with 100 mg·L-1CDs group.

圖5 加入NAC后各組金黃色葡萄球菌菌液濃度

Fig.5 Concentrations ofS.aureusin various groups after treated with NAC

1:Control group;2:0.5 mmol·L-1NAC+100 mg·L-1CDs group;3:100 mg·L-1CDs group;4:0.5 mmol·L-1NAC group.*P<0.05 compared with 100 mg·L-1CDs group.

圖6 加入NAC后各組金黃色葡萄球菌菌落計數

Fig.6 Colony counts ofS.aureusin various groups after treated with NAC

1:Control group;2:100 mg·L-1CDs group;3:0.5 mmol·L-1NAC+100 mg·L-1CDs group;4:0.5 mmol·L-1NAC group.*P<0.01 compared with 100 mg·L-1CDs group.

圖8 加入NAC后各組金黃色葡萄球菌生物膜形成量

Fig.8 Biofilm formation amounts ofS.aureusin various groups after treated with NAC

3 討 論

近年來，隨著耐藥菌的不斷出現，越來越多的細菌感染性疾病治療效果不佳，而細菌感染性疾病的發生發展常與生物膜的形成有密切關聯,這是由于生物膜形成后，細菌具有極強的耐藥性并能干擾宿主免疫系統的識別和殺傷機制，因此成為臨床治療的重大挑戰[14]。金黃色葡萄球菌是革蘭陽性需氧球菌，常見于各種口腔術后急性感染。因其具有較強的成膜作用可為其他致病菌提供保護，最終協同致病，故應對金黃色葡萄球菌感染性疾病的預防和控制給予高度重視。APDT是針對細菌感染性疾病的有效治療和預防而迅速發展起來的一個領域，因與傳統抗生素和消毒藥物抗菌機制不同，APDT可明顯降低細菌耐藥性的產生[15]。D?RTBUDAK等[16]發現：APDT能減少種植體周圍炎的牙周病原菌數量，而且對種植體表面無損傷，因此APDT為口腔疾病的防治提供了新思路。

光敏劑在APDT中是最重要的影響因素之一，但由于其反應過程相對較復雜，涉及許多方面，目前光敏劑較少應用于臨床。因此光敏劑開發非常重要。卟啉類化合物因具有相對較高的活性氧產量，是常用的光敏劑之一。研究[17]顯示：5-氨基酮戊酸(5-aminoketovalerate, ALA)作為一個典型的卟啉類光敏劑，可介導APDT使其具有廣譜的抗微生物效應，因此臨床上可將ALA介導的APDT應用于皮膚病治療，如細菌及真菌感染。但由于ALA介導APDT光照時具有強烈的疼痛感限制了其廣泛應用。TSAI等[18]發現：血卟啉或亞甲藍介導的APDT在照射30 min時可抑制金黃色葡萄球菌生長。NEDA等[19]研究表明：甲苯胺藍在LED照射條件下能有效殺死變異鏈球菌，但具有一定暗毒性，且在未經光照情況下，對變異鏈球菌也有一定的抗菌能力。盡管在上述研究中光敏劑表現出良好的抗病原微生物的作用，但其存在暗毒性較大、單純光動力治療效率低、光激發時間長和不良反應多等諸多問題，因此還需開發更加安全、有效的抗微生物光敏劑。納米半導體材料因其光誘導氧化還原特性和抗菌功能而成為光敏劑熱門選擇，例如目前已被用作抗菌和一般消毒用途的二氧化鈦(TiO2)半導體光催化劑[20]。然而，TiO2需要紫外光(UV)進行激發，UV只占據入射太陽光譜的4%且對生物體有害。此外TiO2帶隙較寬,這些不足制約其在光催化方面的實際應用。

CDs是近年來備受學者關注的新型納米材料,其合成方法簡單多樣，原材料豐富，自然界中含碳材料均能夠提供碳源，同時CDs還具有高化學穩定性、較高溶解度、高光致發光性、抗光漂白性和毒性小的優點[21]，具有良好的光誘導電子轉移能力和光吸收能力。與傳統納米半導體比較,其可見光譜區域更加廣泛且對有機體溫和，有潛力成為理想光敏劑。故本課題組以檸檬酸、乙二胺和醋酸鋅為碳源通過水熱法合成粒徑約1.8 nm CDs并對其進行表征，熒光光譜儀檢測結果表明：激發波長為300 ～400 nm，當激發波長為342 nm時CDs具有最佳發射效果，最佳發射波長為440 nm；FT-IR檢測結果表明：CDs具有多個官能基團，如羥基和羧基等，說明鋅摻雜CDs有較好的水溶性和穩定性。采用CCK-8法檢測鋅摻雜CDs的細胞毒性結果表明：與低濃度CDs共培養后，L929和MC3T3-E1細胞活性無明顯變化，說明鋅摻雜CDs細胞毒性較低。本研究結果表明：CDs單獨應用無抗菌作用，單獨藍光照射20 min時其對金黃色葡萄球菌有抑制作用，CDs和藍光照射聯合應用時抗菌作用明顯增強，藍光照射10 min即可抑制金黃色葡萄球菌生長和生物膜形成；當CDs濃度為100 mg·L-1、藍光照射時間為40 min時，抑制效果最佳。NAC作為強有效的抗氧化物質能夠干擾活性氧的生成、清除已生成的活性氧。因此，本實驗選取NAC對光動力抗菌效果最佳組進行處理，探討CDs能否在藍光激發下產生活性氧，結果顯示：加入NAC后細菌數量及生物膜形成量明顯增加，故推測在該條件下可通過光催化反應產生活性氧，從而對金黃色葡萄球菌產生不可逆傷害。此外，本實驗中采用的藍光波長為400～500 nm，與CDs的最佳激發波長(342 nm)不完全匹配，這可能對CDs光動力效應存在一定影響。在今后的研究中，本課題組將采用更寬譜的光源以期尋找到最佳激發波長從而獲得更好的光動力抗菌效果。

綜上所述，成功制備的鋅摻雜CDs具有粒徑小、水溶性高、熒光性能優異和低毒性特點，且在藍光激發下通過光催化作用能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長和生物膜形成。