飼料中維生素D3的添加水平對黃顙魚幼魚生長和Toll樣受體TLR18、TLR19和TLR21的影響

郭 勛 程 珂 馬春松 陳 昕 王春芳

(華中農業大學水產學院, 淡水水產健康養殖湖北省協同創新中心, 池塘健康養殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070)

維生素D是一種脂溶性維生素, 一般來說, 魚類不能合成維生素D, 必須依靠攝食來滿足其需求[1],維生素D3(VD3)是維生素D最重要的形式, 經魚體吸收后轉化為活性維生素D3, 維生素D3與存在于細胞核內的特異性受體(Vitamin D Receptor, VDR)結合后, 在基因轉錄水平上發揮其重要的調控功能[2]。維生素D3的經典作用主要是維持礦物質的穩態、參與魚類內分泌等[3], 除經典作用外, 在哺乳動物中越來越多的研究表明, 維生素D還可以影響免疫細胞細胞因子的分泌和表達, 從而影響免疫細胞的增殖和凋亡[4], 維生素D3還參與了蛋白質激酶C(Protein Kinase C, PKC)、MAP激酶(Mitogen-activated Protein Kinase, MAPK)、磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)和磷脂酶D(Phospholipase D, PLD)等免疫相關通路[5,6], 相關實驗證明維生素D3也可以有效地干預病毒感染[7]。盡管這些報道表明維生素D3/VDR調節免疫系統功能在哺乳動物中的作用, 但其對魚類營養免疫的作用機理, 有待深入探索。

Toll樣受體(Toll-like Receptors, TLRs)是一類重要的病原體識別分子的受體(Pathogen Recognition Receptors, PRRs), 是溝通機體的先天免疫和獲得性免疫的橋梁[8]。TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白, 主要有富含亮氨酸系列的胞外區、富含半胱氨酸系列的跨膜區和含TIR(Toll-interleukin-1 Receptot)的胞內區3個典型的功能區組成, 胞外區能特異性識別病原體, 胞內區能激活信號通路, 從而調節免疫應答[9], 魚類TLR基因種類較哺乳類動物更多, 目前在硬骨魚類至少發現了20種, 其中TLR18、19、20、21、22、23為魚類所特有[10], 不同的TLRs識別的病原體不同, 細胞外的TLRs主要檢測脂質和蛋白質的配體, 細胞內的TLRs主要檢測核酸的配體[11]。已有研究表明,TLR18可以感受PGN(肽聚糖)、LPS(脂多糖)、Poly(I∶C)(聚肌細胞酸)和寄生蟲的刺激,除上述刺激物外,TLR19和TLR21還可以感受病毒的刺激[12], 三種基因特異性識別病原體后, 啟動一系列信號級聯, 從而導致免疫因子的產生[13], 然而其具體的作用機制仍待進一步研究。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是我國重要的淡水養殖品種, 由于其較高的市場價值, 黃顙魚養殖規模日益增大[14]。但在密集的養殖環境下, 細菌性傳染病發病的頻率越來越高, 造成嚴重的經濟損失, “裂頭病”就是一種典型的黃顙魚疾病, 已有研究表明這種疾病是由鮰愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)引起的[15]。傳統的藥物治療法存在藥物殘留和耐藥性等安全問題, 疫苗預防法存在操作復雜和特異性強的問題。因此, 采用營養調控手段, 來增強黃顙魚對病原的抵抗力是防治相關疾病的有效措施之一[16]。

本實驗通過研究飼料中維生素D3的不同添加水平對鮰愛德華氏菌攻毒前后黃顙魚主要免疫組織中的三種典型Toll樣受體家族基因TLR18、TLR19和TLR21表達的影響, 以期揭示維生素D3在魚類免疫調控中的作用, 分析黃顙魚在營養調控后對易感病原抵抗能力的變化, 初步篩選出提高黃顙魚免疫應答的飼料中維生素D3的適宜水平。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料的制作

以酪蛋白和脫脂奶粉為蛋白源、玉米蛋白粉為糖源、大豆油為脂肪源配制成5組不同維生素D3含量等氮等能飼料, 飼料組成和營養成分見表1。在飼料制作時, 各原料采取逐級放大法混勻, 最后加入20%的蒸餾水揉勻, 經制粒機加工后粉碎成適宜大小的顆粒, 37℃晾干至飼料水分低于10%,-20℃冰箱保存待用。

1.2 試驗魚及其飼養

試驗黃顙魚購于武漢正好魚苗廠, 為了使試驗魚適應養殖環境以及排除魚體殘存的維生素D3的影響, 正式試驗前進行為期3周的暫養, 暫養期間投喂對照組飼料。在暫養結束后, 試驗魚饑餓24h后稱重, 挑選出體格健壯、規格一致的黃顙魚(5.0±0.2) g 800尾隨機放入循環水養殖系統中的20個纖維玻璃魚缸中(內徑85 cm內高70 cm)。每組試驗飼料對應4缸重復, 每缸40尾魚。養殖試驗在華中農業大學水產樓附1樓013魚房內進行。

生長試驗持續12周(2017.07.22—2017.10.17),采用飽食性投喂策略, 每天投喂2次(9:00 am和15:00 pm), 每天稱取定量的飼料(約為魚重的6%),投喂時采用多次少量投喂策略, 直至魚飽食為止,稱量剩余飼料量以確定投喂量, 每兩周全缸稱重以調整投喂量, 試驗期間水流約為1.5 L/min, 水溫為16.0—26.0℃, 溶解氧濃度大于6.0 mg/L, 氨氮濃度低于0.5 mg/L, pH在8.0左右。

表1 實驗飼料組成和營養成分Tab. 1 Formulation and proximate composition of experimental diets

1.3 生長性能的測定

在生長實驗結束后, 從每組中取24尾黃顙魚(每個重復隨機取6尾), 稱重, 用于計算以下相關生長指標。

式中,WG表示增重率;TGC表示積溫系數;FCR表示餌料系數;FE表示餌料效率;SUR表示存活率;FBW和IBW分別為魚體的末體質量和初體質量;d為養殖天數,t為養殖水溫。

1.4 攻毒實驗

在生長實驗結束后, 每個飼料組隨機選取55條黃顙魚, 注射鮰愛德華氏菌進行攻毒實驗, 細菌經腦心浸液培養基(Brain Heart Infusion, BHI)培養后用無菌生理鹽水將菌液濃度稀釋為3.14×108CFU/mL(攻毒實驗前進行預實驗確定的致半死濃度), 每尾魚經腹腔注射0.1 mL的菌液, 攻毒期間不喂食,水體充氧, 不循環, 攻毒后6h開始觀察黃顙魚臨床癥狀, 記錄攻毒后黃顙魚的死亡數, 計算各實驗組的死亡率和免疫保護率, 其中免疫保護率(%)=100×(1-實驗組死亡率/對照組死亡率); 并于攻毒前 (0)和攻毒后(72h) 采樣, 在每個采樣點, 每個飼料組分別取6條魚的頭腎、脾臟、肝臟和前腸四個組織,另取6條新鮮黃顙魚的肌肉、頭腎、腎臟、皮膚、腦、鰓、脾臟、胃上皮、小腸和肝臟, 所有取出的組織立即放入液氮速凍, 然后放入-80℃備用。

1.5 指標的測定

主要試劑和儀器 Trizol購自Invitrogen公司, Sample Protector、DL2000DNA Maker、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion2.0)和反轉錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶生生物工程(大連)有限公司, 熒光定量試劑盒HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)購自翊圣生物科技(上海)有限公司。

引物的設計與合成利用NCBI數據庫中的黃顙魚TLR18基因序列(GenBank: KY123645.1)、TLR19基因序列(GenBank: KY123646.1)、TLR21基因序列(GenBank: KY123647.1)和β-actin基因序列(GenBank: KM673246.1), 利用Primier5.0軟件設計相關基因的引物, 引物由上海生工生物公司合成。

總RNA的提取和cDNA的合成取黃顙魚冷凍組織, 用trizol法提取其總RNA, 提取的總RNA用Nana Drop分光光度計測定其濃度和純度,A260/A280值在1.8—2.0。瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S條帶明亮清晰且28S條帶亮度是18S的兩倍。cDNA第一鏈的合成參照PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒方法進行。首先進行基因組DNA的除去反應。反應體系: 5× gDNA Eraser Buffer 2 μL, gDNA Eraser 1 μL, Total RNA ＜1 μg, 加無菌蒸餾水至10 μL。反應條件: 42℃2min。然后進行反轉錄反應。反應體系: 5× Prime Script?Buffer 2 (for Real time) 4 μL, PrimeScript?RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL, RT Primer Mix 1 μL, 基因組DNA除去反應的反應液10 μL, 加無菌蒸餾水至20 μL。反應條件: 37℃ 15min, 85℃ 5s。合成的cDNA放入-20℃冰箱中保存備用。

RT-PCR以得到的cDNA為模板用Quan Studio 6 Flex RT-PCR儀進行擴增, Real-time PCR反應體系: HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus)10 μL, 上下游引物 (10 μmol/L) 各0.4 μL(表2), cDNA溶液2 μL, 加無菌蒸餾水至20 μL。反應條件為: 95℃ 10s, 60℃ 20s, 72℃ 20s, 40個循環。

表2 Real-time PCR所用引物Tab. 2 Primers used for real-time PCR

1.6 數據處理

mRNA表達量用2-ΔΔCt法進行相對定量分析, 其中ΔΔCt=(Ct靶基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct靶基因-Ct內參基因)對照組, 試驗數據以平均值±標準誤表示,采用SPSS16.0進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析, 若組間差異顯著(P＜0.05), 采用鄧肯檢驗法(Duncan’s)進行多重比較分析。

2 結果

2.1 飼料中維生素D3的添加水平對黃顙魚生長性能的影響

表3顯示, 在飼料中添加維生素D3對黃顙魚幼魚的TGC和存活率沒有影響(P＞0.05)。當維生素D3添加濃度為16600 IU/kg時, 黃顙魚增重率和飼料效率達到最大, 飼料系數最小(P＜0.05)。

表3 在飼料中添加維生素D3對黃顙魚幼魚生長的影響Tab. 3 Effects of dietary vitamin D3 levels on the growth performance of juvenile P.fulvidraco

2.2 飼料中維生素D3的添加水平對活菌攻毒后黃顙魚的死亡率和免疫保護率的影響

表4顯示, 經腹腔注射鮰愛德華氏菌后, 維生素D3濃度為1120 IU/kg時, 黃顙魚累積死亡率達到最高, 且累積死亡率隨著飼料中維生素D3濃度的升高而增大, 免疫保護率隨著飼料中維生素D3的濃度升高而減小, 在維生素D3濃度為16600 IU/kg時, 免疫保護率達到最大。

表4 在飼料中維生素D3添加水平對黃顙魚疾病抗性的影響Tab. 4 Effects of vitamin D3 supplementation on the disease resistance of P. fulvidraco

2.3 黃顙魚TLR 18、TLR19和TLR21基因的組織分布

以TLR19基因和TLR21基因mRNA表達量最低的肌肉為對照組, 以TLR18基因mRNA表達量最低的腦為對照組, 對肌肉、頭腎、腎臟、皮膚、腦、鰓、脾臟、胃上皮、小腸和肝臟中5種基因的mRNA表達量進行相對定量分析, 得到黃顙魚體內5種基因的mRNA組織表達分布圖(圖1), 3個TLR受體家族基因在各組織中都分布廣泛, 其中,TLR18基因在頭腎、脾臟和肝臟中的表達量較高(P＜0.05);TLR19基因在頭腎和脾臟中的表達量較高(P＜0.05);TLR21基因在脾臟中的表達量最高(P＜0.05)。

2.4 鮰愛德華氏菌刺激前后黃顙魚TLR18、TLR19和TLR21基因

TLR18基因mRNA表達量的變化由圖2可知, 相對于攻毒前水平, 攻毒后,TLR18 mRNA表達量在頭腎、脾臟、肝臟和前腸中就有提高, 頭腎中TLR18 mRNA的表達量在飼料VD3含量為2260和16600 IU/kg時顯著高于其他處理組, 在8030 IU/kg時表達量最低(P＜0.05); 脾臟TLR18 mRNA表達量隨飼料中維生素D3含量增加而下降(P＜0.05); 肝臟TLR18 mRNA表達量在16600 IU/kg時最高, 在3950 IU/kg時表達量最低(P＜0.05); 而在前腸中TLR18 mRNA表達量在低濃度維生素D3處理組(1120 IU/kg)顯著高于其他處理組(P＜0.05)。

TLR19基因mRNA表達量的變化由圖3可知, 和攻毒前相比, 在脾臟、肝臟、前腸以及高濃度VD3處理組的頭腎中, 攻毒后TLR19 mRNA的表達量均有所上升。頭腎高濃度VD3處理組(16600 IU/kg)該基因表達高于其他處理組, 但沒有顯著差異(P＞0.05); 在脾臟、肝臟和前腸中,TLR19 mRNA表達量總體上隨維生素D3水平升高顯著下降(P＜0.05)。

TLR21基因mRNA表達量的變化由圖4可知, 和攻毒前相比, 在頭腎、脾臟、肝臟和前腸中, 攻毒后TLR21 mRNA的表達量均高于攻毒前。總體來說, 攻毒后,TLR21 mRNA基因表達隨著飼料中VD3濃度的升高而呈下降趨勢(P＜0.05)。在4種免疫組織中, 高濃度VD3處理組(16600 IU/kg)該基因表達顯著低于其他處理組(P＜0.05)。

3 討論

Toll樣基因的mRNA廣泛的分布在硬骨魚類中的各個組織中, 但不同的TLR基因在不同的魚類表達模式不同。已有研究表明, 在斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)中,TLR18、TLR19和TLR21在脾臟或是在肝臟中表達量最高, 在其他組織中表達量相對較少[17],TLR18在大西洋鮭(Salmo salar)的頭腎分布較少, 在肝臟中分布最高,TLR19和TLR21在大西洋鮭的頭腎和脾臟中表達量最高[18],TLR21在草魚(Ctenopharyngodon idellus)的皮膚、頭腎和脾臟中表達量相對較高[19]。在本研究中,TLR18、TLR19和TLR21在所檢測的組織中均有表達, 其中,TLR18在脾臟中表達量最高, 但在頭腎和肝臟中同樣高表達, 而TLR19和TLR21在脾臟中的表達量顯著高于其他組織, 其次為頭腎組織。本結果證實了Wang等[20]在黃顙魚中的發現, 但與其他魚中已有的研究成果有所不同, 可能是由于物種的差異性, 同一基因的mRNA在不同魚類的分布具有特異性。

圖1 黃顙魚TLR18 (A)、TLR19 (B)和TLR21 (C)基因mRNA組織表達分布Fig. 1 Tissue distribution of TLR18(A), TLR19(B), and TLR21(C) mRNA in Pelteobagrus fulvidraco

圖2 攻毒前后TLR18 mRNA在黃顙魚頭腎(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和前腸(D)中相對表達量的變化Fig. 2 Changes in the relative mRNA expression levels of the TLR18 gene in the head kidney, spleen, liver and anterior intestine after the Edwardsiella ictaluri stimulation

圖3 攻毒前后TLR19 mRNA在黃顙魚頭腎(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和前腸(D)中相對表達量的變化Fig. 3 Changes in the relative mRNA expression levels of the TLR19 gene in the head kidney, spleen, liver and anterior intestine after the Edwardsiella ictaluri stimulation

炎癥是機體自身的一種保護性反應, 以確保消除有害刺激, 修復受損組織的愈合過程, 微生物對細胞的感染會激活炎癥反應, 感染的初始由先天模式識別受體(PRRs)介導[21], TLRs是最常見的PRRs,TLRs識別特定的配體, 然后通過MyD88(Myeloid Differentiation Factor 88)信號通路或者TRIF(TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β)信號通路, 激活核轉錄因子(Nuclear Factor κB, NF-κB), 進而產生促炎細胞因子[22]。到目前為止, TLR家族可以分為TLR1/3/4/5/7/11六種亞家族, 我們當前實驗研究的主體是TLR18、TLR19和TLR21。TLR18是魚類特有的基因, 隸屬于TLR1亞家族, 已經被證明在硬骨魚類的免疫中有重要作用[23]。TLR19和TLR21都屬于TLR11亞家族, 大部分TLR11亞家族的成員都僅在魚類和青蛙中發現[24]。TLR18與哺乳動物中的TLR6和TLR10類似, 用嗜水氣單胞菌感染草魚后, 草魚體內的TLR18表達量會顯著升高, 從而激活NF-κB通路, 發生炎癥[25]。TLR19基因序列非常保守, 優先作用于細胞內, 能夠準確識別寄生蟲的感染, 研究已經證實TLR19和斑點叉尾鮰抗小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)的免疫反應相關[26],TLR21結構與TLR11相似, 牙鲆(Paralichthy solivaceus)受到鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染后, 體內的TLR21表達量上調[27]; 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)中TLR21和抗海水白點蟲病(Cryptocaryon irritans)的免疫反應相關[28]。由于TLR18、TLR19和TLR21在病原識別后信號轉導的相似性比較高[29], 因此我們可以將此三個基因同時進行研究。在本研究中, 我們探討了飼料中添加不同含量維生素D3喂養12周后, 再經過鮰愛德華氏菌攻毒后, 脾臟、頭腎、肝臟和前腸中TLR18、TLR19和TLR21的表達。結果表明: 和攻毒前相比, 四個組織中攻毒后TLR18、TLR19和TLR21的表達都顯著上升。這一結果與Wang等[20]在對經過LPS和Poly(I∶C)刺激后黃顙魚中報道的結果一致:TLR18、TLR19和TLR21在脾臟、肝臟、頭腎和血液中的表達量均增高。與斑點叉尾鮰中結果部分一致: 愛德華氏菌感染斑點叉尾鮰后, 其肝臟和脾臟中的TLR18、TLR19和TLR21表達量顯著上調, 但頭腎中的TLR18、TLR19和TLR21的表達量會出現顯著下調[30]。本研究中的結果和文獻中報道的結果都表明,TLR18、TLR19和TLR21在針對革蘭氏陰性/陽性細菌和病毒的免疫應答中都起重要作用, 促進了炎癥的發生。至于愛德華氏菌感染斑點叉尾鮰后頭腎中此3個基因表達模式與黃顙魚不一致, 也許存在物種特異性, 具體原因還有待進一步研究。

維生素D3是一種具有廣泛生理效應的內分泌激素, 動物實驗表明其對機體免疫影響的機制在分子水平上可以分為兩種, 第一種是維生素D3與免疫細胞的VDR結合, 影響細胞的增殖分化和細胞因子的產生; 第二種是維生素D3可以活化免疫細胞的Toll樣受體, 從而發揮免疫作用[31], 魚類此方面的研究較少, 有關維生素D3在魚類免疫中作用及機制仍待深入探索。已有研究表明適宜的維生素D3添加量可以顯著的提高歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)[32]、黃鱔(Monopterus albus)[33]和金頭鯛(Sparus auratus)[34]相關免疫基因在免疫組織中的表達量。本實驗結果也表明, 飼料中不同的維生素D3的添加水平顯著影響TLR18、TLR19和TLR21在黃顙魚頭腎、脾臟、肝臟和前腸4個組織中的表達, 不論是攻毒前還是攻毒后, 維生素D3對此三個基因的影響都存在濃度劑量關系, 證實維生素D3對黃顙魚免疫的調節作用。總體而言, 以組織表達量最高的脾臟為例,TLR18、TLR19和TLR21的表達基本隨著飼料中維生素D3含量的增加而下降, 表明飼料中適宜濃度的維生素D3會促進TLR18、TLR19和TLR21的表達, 高濃度的維生素D3會抑制TLR18、TLR19和TLR21的表達, 維生素D3通過影響相關免疫基因的表達從而避免了魚體細菌感染的發生。

圖4 攻毒前后TLR21 mRNA在黃顙魚頭腎(A)、脾臟(B)、肝臟(C)和前腸(D)中相對表達量的變化Fig. 4 Changes in the relative mRNA expression levels of the TLR21 gene in the head kidney, spleen, liver and anterior intestine after the Edwardsiella ictaluri stimulation

4 結論

本研究探討了黃顙魚幼魚經過為期12周的維生素D3營養調控后, 再經致病菌攻毒后, 維生素D3的添加對黃顙魚生長和Toll類受體TLR18、TLR19和TLR21表達的影響。結果顯示, 適宜維生素D3濃度促進黃顙魚生長和Toll類受體TLR18、TLR19和TLR21表達, 并發現TLR18、TLR19和TLR21在不同組織中的表達和飼料中維生素D3的濃度相關, 本研究結果證實了飼料中添加合適劑量的維生素D3, 可以促進相關免疫基因的表達, 從而增強黃顙魚對病原微生物的抵抗力, 高濃度的維生素D3會抑制TLR18、TLR19和TLR21的表達, 維生素D3通過影響相關免疫基因的表達從而避免了魚體細菌感染的發生。本結果為采用添加合適劑量的維生素D3來增強魚類的免疫能力, 制作能提高魚類免疫力的飼料提供了研究基礎。