金屬尾礦庫生物土壤結皮的類型及物種組成

胡 瑤 彭成榮 李敦海

(1. 中國科學院水生生物研究所中國科學院藻類生物學重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學，北京 100049)

尾礦庫作為礦山的三大基礎設施之一, 是用于堆存金屬礦石或非金屬礦石粉碎選別后所殘余的有用成分含量低、當前經濟技術條件下不宜進一步分選的固體廢棄材料[1]。隨著人類社會對礦產資源依賴程度的加劇, 一方面由于老舊礦山礦產資源耗竭而產生諸多廢棄的尾礦庫, 另一方面由于新礦山的開采而產生新的尾礦庫, 尾礦庫數量依舊處于較高水平, 據統計, 截至2015年底, 全國仍有“頭頂庫”1425座。金屬尾礦庫通常由于極高的重金屬含量、極端的pH和極低的有機質含量限制了其向正常土壤的發育[2,3], 其自然恢復要經過50—100年的時間才能形成較好的植被覆蓋[4]。常規的生態修復包括植物、動物和微生物修復, 該方法環保且成本低, 但金屬尾礦庫的極端條件限制了該環境下動植物的正常生長, 導致常規方法在金屬尾礦庫的早期修復中很難有效, 因此改善尾礦庫環境和土壤質量以保證植被恢復是促進生態系統的快速恢復的前提[3]。

生物土壤結皮(Biological soil crusts, BSCs)是由藻類、地衣、苔蘚、細菌和真菌等生物組分與其下薄層土壤結合形成的一種復雜的生物土壤復合體[5]。根據發育程度和優勢種群的差異, 可將BSCs分為藻結皮、地衣結皮及苔蘚結皮三個明顯不同的演替階段, 三個階段依次從簡單到復雜, 從低等到高等, 有時也會出現藻-地衣結皮、藻-蘚結皮等中間型[6,7]。BSCs具有很強的環境適應性, 廣泛分布于各種生境中, 尤其在一些維管束植物通常難以定植的退化生境中, BSCs的覆蓋率可以高達70%,在改善極端土壤環境中具有重要作用[8]。

不同的退化生境具有不同的環境特征, 其適生的BSCs物種組成也有所不同。在干旱和半干旱地區, 通過對BSCs物種組成的解析發展出了一種行之有效的人工生物土壤結皮技術, 在我國北方荒漠化治理中發揮了重要的作用[9,10]。在尾礦庫的修復中, 植被恢復被認為是減少水蝕和風蝕以及保護周圍環境的傳統有效手段之一[11], 金屬尾礦庫作為一種嚴重退化的污染生境, BSCs往往是最初拓殖的生物復合體。而對尾礦庫現有物種的調查是篩選適生的先鋒物種的必由之路。盡管一些研究嘗試將生物土壤結皮應用于尾礦庫的治理或修復[12,13],但這些嘗試都是應用通識藻種, 并未針對尾礦庫進行適生先鋒物種的篩選。目前對尾礦庫中的BSCs的物種組成所知甚少[14], 這限制了對BSCs在尾礦庫中的生態功能的理解。因此, 本研究以兩個廢棄時間不同的尾礦庫作為研究位點, 對其中的BSCs進行廣泛的調查與分析, 采用空間代替時間的方式來表征結皮的演替年代, 以期能揭示重金屬污染環境中BSCs的物種組成及其生態學意義, 為尾礦庫的生態修復提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點概述

本研究選取湖北省黃石市的雞籠山金礦尾礦庫(JLS; 29°49′15.1″ N, 115°24′41.4″ E)和牛頭山銅礦尾礦庫(NTS; 29°57′2.6″ N, 115°5′42.8″ E)兩個廢棄尾礦庫進行調查研究, 其中JLS已廢棄30余年, NTS廢棄約8年。JLS尾礦庫約3/5地表被草本植物覆蓋, 約1/5地表被生物土壤結皮覆蓋, 主要有藻-蘚結皮、苔蘚結皮、藻結皮, 剩余約1/5地表呈裸露狀態。NTS尾礦庫地表有少許草本植物零落分布, 約3/4地表被結皮覆蓋, 主要為苔蘚結皮、蘚-藻結皮、藻結皮。

1.2 樣品采集與預處理

本研究于2016年7月進行。根據每個尾礦庫地表結皮類型及立地條件, 選取結皮生長較為一致且人為干擾較少的地方設置樣方。根據結皮中藻類和苔蘚優勢度的不同, 劃分為物理結皮、藻結皮、藻-蘚結皮、蘚-藻結皮及苔蘚結皮5種樣地(圖1),每個樣地內各選取2個2 m×2 m樣方, 每個樣方內采集3個重復樣品。在每個樣方內采集結皮層, 置于無菌的塑料培養皿內, 其中藻結皮、藻-蘚結皮、物理結皮厚度約0.3 cm, 蘚-藻結皮、苔蘚結皮厚度約為0.7 cm。同時, 采集結皮下0—5 cm土層作為土壤層樣品, 置于封口袋中。將用于微生物分析的樣品裝入無菌的EP管中, 立即放入冰盒中, 運回實驗室后于-40 ℃冰箱保存, 用于DNA提取和后續微生物分析。土壤和結皮樣品采集的同時現場測定結皮的蓋度, 蓋度的測定方法參考相關文獻[15]。兩個尾礦庫中結皮的采集情況見表1。在實驗室將一部分土壤樣品攤開風干, 去除其中的動植物殘體及石子, 研磨過篩, 用于土壤理化和重金屬含量分析。

圖1 尾礦庫及其中分布的主要生物土壤結皮Fig. 1 The tailings pond and the biological soil crusts

1.3 土壤層與結皮層基本理化性質測定

土壤含水量(WC)采用105 ℃烘干法測定, pH用pH計測定水土比為5∶1的懸浮液, 有機質(OM)采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定, 總氮(TN)采用凱氏法測定, 速效氮(AN)采用堿解擴散法測定,速效磷(AP)采用鉬銻抗比色法測定, 速效鉀(AK)采用火焰光度計測定, 上述指標的測定參照《土壤農業化學分析方法》[16]?？偭?TP)采用鉬銻抗比色法測定, 總鉀(TK)采用火焰光度計測定, 上述指標的測定參照《土壤農化分析》(第三版)[17]。

表1 尾礦庫樣品采集情況Tab. 1 Samples of biological soil crusts in different tailings ponds

1.4 土壤層重金屬含量測定及污染評價

重金屬的含量使用電感耦合等離子體-發射光譜儀(ICP-OES)進行測定。參考我國土壤環境二級標準, 采用內梅羅綜合污染指數法評價標準對土壤重金屬污染水平進行評價, 內梅羅綜合污染指數計算公式如下[18,19]:

式中,Pm為某地區的綜合污染指數;Ci為污染物i的實測含量(單位mg/kg);Si為污染物i的評價標準(單位mg/kg), 本研究中Si采用我國土壤環境二級標準; (Ci/Si)max為土壤污染物中單因子污染指數最大值; (Ci/Si)ave為土壤污染物中單因子污染指數平均值。本研究取尾礦庫不同類型結皮下的土壤層的平均結果計算該尾礦庫的各種理化指標、重金屬含量及綜合污染指數。

1.5 結皮色素含量測定

稱取1.00 g風干的結皮樣品, 充分研磨后加入5 mL純丙酮, 4 ℃黑暗提取24h。于4 ℃下, 8000 r/min離心10min, 取上清, 用分光光度計測定384、490、663和750 nm處的光吸收值。按下列3個公式對葉綠素a(Chl.a)、類胡蘿卜素(Car)和偽枝藻素(Scyt)吸光值進行修正[20]:

并根據葉綠素a、類胡蘿卜素及偽枝藻素在丙酮中的消光系數92.5、250和112.6分別計算單位重量(干重, DW)結皮的葉綠素a、類胡蘿卜素及偽枝藻素含量, 表示為μg/g DW。

1.6 結皮中藍藻、真菌、苔蘚豐度測定

使用Bio-Rad公司的熒光定量PCR擴增儀(CFX 96TMReal-Time system), 采用定量PCR (qPCR)方法檢測藍藻、真菌和苔蘚的豐度, 分別采用藍藻16S rRNA基因、真菌25-28S rRNA及苔蘚葉綠體rps4基因作為遺傳學標記, 其豐度來間接表示藍藻、真菌、苔蘚的生物量[21], 所用引物見表2。

表2 藍藻、真菌、苔蘚目的基因及引物Tab. 2 Primers for cyanobacteria, fungi and moss

1.7 結皮微生物組成分析

結皮基因組DNA的提取在樣品采集后2周內完成, 使用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒進行提取, 采用瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行完整性檢測, 采用Nanodrop 2000 (Thermo, 美國)測定DNA樣品濃度和純度。然后基于HiSeq PE250平臺, 利用雙末端測序 (Paired-End 250)的方法, 以bar-coded 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGTAA-3′)和bar-cod 806R(5′-GGACATCHVGGGTWTCTAAT-5′)為引物對16S rRNA基因的V4區進行擴增, 構建小片段文庫進行雙末端測序。對樣品Reads進行拼接和過濾, OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種注釋, 并進行豐度分析和多樣性分析。

1.8 統計分析

結皮層指標之間采用one-way ANOVA進行方差分析, 結皮層與土壤層之間采用t檢驗進行分析,以上分析均在SPSS 20軟件上進行。使用Qiime軟件 (Version 1.7.0)計算微生物的物種數 (Observed species)、Chao1指數、ACE指數、Shannon多樣性指數、Simpson多樣性指數, 使用R語言進行Alpha多樣性指數組間差異分析; Alpha多樣性指數組間差異分別進行有參數檢驗和非參數檢驗, 選用T-test和wilcox檢驗。

2 結果

2.1 尾礦庫土壤理化性質測定及重金屬污染評價

JLS和NTS尾礦庫的土壤基本理化性質見表3。兩個尾礦庫土壤呈弱堿性, 且JLS土壤pH顯著低于NTS(P＜0.05), 而JLS土壤的OM、TN、AK顯著高于NTS(P＜0.05)。根據全國土壤普查辦公室對土壤養分的分級[22], JLS和NTS尾礦庫中的大部分養分含量均為Ⅵ級, 因此兩個尾礦庫土壤均十分貧瘠。兩個尾礦庫的主要重金屬含量見表4。結果顯示兩個尾礦庫土壤中都是Cu的含量最高, 其次是Zn, 而Cd的含量最低, 且土壤中不同重金屬含量差異較大。從內梅羅綜合污染指數來看(表4), JLS尾礦庫屬于重度污染水平, 而NTS尾礦庫屬于輕度污染水平, 但仍然超過了警戒線水平。

2.2 不同演替階段生物土壤結皮的生物量及藍藻、真菌、苔蘚豐度

分別對結皮層和土壤層中葉綠素a、類胡蘿卜素和偽枝藻素含量進行測定, 葉綠素a含量來表示結皮的主要光合生物量(圖2)。JLS和NTS尾礦庫的結皮下層土壤中的葉綠素a、類胡蘿卜素和偽枝藻素含量均接近于零, 可見土壤中的光合生物主要分布于結皮層, 特別是生物土壤結皮(BSCs)階段的結皮層。物理結皮(PC)階段時, 結皮層的三種色素含量均表現為最低, 且顯著低于生物土壤結皮階段, 但此時JLS的三種色素含量顯著高于土壤層, 而NTS無顯著差異。在JLS尾礦庫中, 隨著結皮從A、AM到M的演替, 結皮層葉綠素a呈逐漸增加趨勢, 類胡蘿卜素含量呈下降趨勢, 偽枝藻素含量無顯著變化。在NTS尾礦庫中, 從A、AM到M2的演替過程中, 結皮層的葉綠素a與類胡蘿卜素含量呈逐漸增加趨勢, 偽枝藻素含量呈先增加后降低趨勢。M1階段是苔蘚結皮發育的早期階段,其結皮層的三種色素含量均處于A階段和AM階段之間, 且結皮層三種色素含量均顯著低于發育后期的M2階段。

表3 JLS和NTS尾礦庫土壤的理化指標Tab. 3 Physical and chemical parameters of soils from the two tailings ponds

表4 JLS和NTS尾礦庫土壤的重金屬含量及重金屬污染評價Tab. 4 Heavy metal contents of soils and Nemerow multi-factor index in the two tailings ponds

對藍藻16S rRNA基因、真菌25—28S rRNA基因及苔蘚葉綠體rps4基因進行絕對定量qPCR, 用其豐度來表示結皮中藍藻、真菌、苔蘚的絕對豐度,測定結果如圖3所示。BSCs中藍藻、真菌和苔蘚的絕對豐度分別為(0.63—2.01)×108、(0.19—1.53)×108和(0.08—3.34)×107copies/g DW soil; 物理結皮(PC)中藍藻、真菌和苔蘚的絕對豐度分別為(0.54—4.05)×107、(0.43—4.26)×106和(2.76—8.37)×105copies/g DW soil。不同廢棄年代尾礦庫中隨著結皮的發育演替, 其藍藻、真菌、苔蘚豐度變化趨勢有所差異。在JLS和NTS中, PC的藍藻、真菌和苔蘚絕對豐度均顯著低于BSCs。同時在JLS中, 隨著結皮的發育演替, 其藍藻、真菌、苔蘚的絕對豐度均呈增加趨勢。在NTS中, 藍藻絕對豐度隨著發育演替逐漸降低; 真菌絕對豐度在M2階段最高,M1階段最低。M1和M2階段具有不同的物種組成,M1階段具有較高的苔蘚豐度, 但是其藍藻和真菌絕對豐度遠低于A和AM, 表明M1處于結皮發育的早期階段。結合M1階段的三種色素含量顯著低于M2的現象(圖2), 推測M1不經過藻結皮階段, 而是苔蘚直接在土壤拓殖而形成苔蘚結皮, 故結皮中藍藻豐度較低。而M2階段藍藻、真菌和苔蘚的絕對豐度都處于較高水平, 表明其處于結皮發育的晚期階段。

將藍藻、真菌、苔蘚絕對豐度之和視為結皮總生物量, 對結皮中藍藻、真菌、苔蘚豐度比進行計算(圖4)。PC階段藍藻占結皮整體生物量(藍藻、真菌、苔蘚絕對豐度之和)的比例高達86%—89%, 而BSCs階段藍藻比例較低, 為35%—76%。JLS和NTS中隨著結皮的演替, 結皮中藍藻、真菌、苔蘚豐度比例呈現相似的規律, 即隨著結皮從物理結皮到苔蘚結皮的演替, 結皮中藍藻比例呈逐漸下降趨勢, 真菌和苔蘚比例呈逐漸上升趨勢。

2.3 不同演替階段生物土壤結皮的微生物群落結構

JLS和NTS尾礦庫之間的微生物物種數、物種豐富度指數ACE和chao1均不存在顯著性的差異(圖5)。wilcox檢驗表明JLS的Shannon和Simpson多樣性指數顯著高于NTS(圖5,P＜0.05)。利用Amova分析進行組間群落結構差異檢驗, 結果表明JLS和NTS尾礦庫之間微生物群落結構存在顯著差異(P=0.005)。

分別對JLS和NTS尾礦庫中不同演替階段結皮在門水平上的微生物組成進行分析, 發現變形菌門、藍藻門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、芽孢單菌門、熱微菌門為結皮微生物的主要組成部分, 其相對豐度總和達到90%以上(圖6)。其中變形菌門相對豐度最高, 達到32.5%—49.8%。JLS中PC階段藍藻門相對豐度高于三種生物土壤結皮階段。隨著結皮的發育演替, 變形菌門和藍藻門相對豐度呈下降趨勢, 其他微生物的相對豐度呈上升趨勢, 說明隨著結皮的演替其微生物的物種組成向多元化方向發展。放線菌門和芽孢單菌門相對豐度在A階段最高, 隨著結皮從A、AM到M階段演替, 兩者相對豐度呈降低趨勢, 而綠彎菌門和浮霉菌門相對豐度呈上升趨勢。擬桿菌門相對豐度隨結皮演替變化不大。在NTS中, 隨著結皮從PC、A到AM階段演替,變形菌門和芽孢單菌門相對豐度逐漸降低, 疣微菌門和浮霉菌門相對豐度逐漸升高, 到M1和M2階段變形菌門相對豐度有所上升, 疣微菌門和浮霉菌門相對豐度有所下降。與JLS不同, NTS中A階段藍藻門相對豐度最高, AM階段藍藻門相對豐度最低。M1與M2相比, 變形菌門、擬桿菌門相對豐度較高,而藍藻門、綠彎菌門相對豐度較低。

圖2 JLS和NTS尾礦庫中結皮層與土壤層的色素含量Fig. 2 The contents of pigments in the soil crust layers and their underlying soil layers of the two tailings ponds

3 討論

圖3 結皮中藍藻16S rRNA基因、真菌25—28S rRNA基因及苔蘚葉綠體rps4基因絕對豐度(小寫字母用于表示樣品間的差異性, P＜0.05)Fig. 3 Gene copies of cyanobacterial 16S rRNA, fungal 25—28S rRNA and moss chloroplast rps4 in crusts, significant differences between samples are marked with lowercase letters (P＜0.05)

圖4 結皮中苔蘚rps4基因、真菌25—28S rRNA基因及藍藻16S rRNA基因豐度的百分比Fig. 4 The percentage of total gene copies present as gene copies of moss chloroplast rps4, fungal25—28S rRNA and cyanobacterial 16S rRNA

圖5 尾礦庫水平微生物的物種數、chao1指數、ACE指數、Shannon指數和Simpson指數Fig. 5 Observed species, chao1 index, ACE index, Shannon index and Simpson index between the two tailings ponds

尾礦通常來源于很深的地層, 因此有機質的含量十分稀少。JLS和TLS尾礦庫地理位置接近, 且無明顯的人類活動干擾, 但土壤的pH和OM、TN、AK等營養指標顯著的不同(表3), 這可能是由于生物土壤結皮的自然發育和演替所導致的。尾礦庫有機質和營養成分的增加有助于加速向正常土壤的發育[23,24]。以還原性硫化礦物為主的金屬尾礦庫在經過開采、提取、選礦后, 往往產生大量高濃度的酸性廢水, 直接排放會嚴重污染尾礦庫周圍環境, 因此常在廢水排出前使用堿性中和劑使排出的廢水達到基本的排放標準, 所以本研究中發現的尾礦庫pH相對較高, 在一定程度上減少了酸性廢水的直接污染[25—27]。土壤有機質被普遍認為是保持土壤肥力, 保護土壤免受污染、退化、侵蝕和荒漠化侵害的最重要因素之一, 在半干旱地區尤為重要[2,28]。盡管JLS和NTS尾礦庫土壤分別屬于重度污染和輕度污染水平, 高等植物難以生存, 但各種類型的生物土壤結皮仍然能在其中生長(圖1), 這表明生物土壤結皮能夠適應尾礦庫這一極端退化環境。隨著結皮在尾礦庫中的發育與演替, 結皮生物量逐漸的增加(圖2), 這與干旱和半干旱地區的研究結果類似[10,29], 但下層土壤所受到的影響較小, 這可能是由于尾礦庫土壤結構緊密不利于水分滲透導致的。在廢棄時間較久的JLS尾礦庫, 對各個類型結皮的基因拷貝數來說藍藻＞真菌＞苔蘚(圖3), 但是隨著結皮的逐漸演替, 整體生物量上升的同時, 藍藻基因豐度所占的比例逐漸減少, 而苔蘚與真菌的豐度逐漸增加(圖4)。沙漠地區的研究結果也表明隨著結皮逐漸發育, BSCs中藍藻和真菌相對生物量呈下降趨勢, 苔蘚相對生物量呈上升趨勢[21]。而對于廢棄時間較短的NTS尾礦庫來說, 這一規律同樣存在(圖3和圖4)。而在重金屬條件下, 也有研究表明高濃度Cu、Zn、Fe濃度和低營養含量可以抑制土壤藻類的生長, 尾礦中的土壤藻類的種類和豐度隨著早期演替過程而增加, 但苔蘚和維管植物的出現卻抑制了土壤藻類的生長[30]。雖有差異, 這些研究均表明苔蘚的出現會在一定程度上抑制藻類的生長, 且在演替后期苔蘚是結皮中主要的光合生物[31]。

微生物廣泛存在于結皮發育的各個階段, 對土壤物質循環和能量流動起到重要作用。Janssen[32]在對來自多種類型土壤的32個克隆文庫的調查中發現, 土壤細菌至少包含32個門, 健康的土壤中的優勢微生物群落有變形菌門、酸桿菌門、放線菌、疣微菌門、擬桿菌、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門和厚壁菌門, 這9個門的成員平均占土壤微生物克隆文庫總豐度的92%。本研究采用高通量測序對結皮的微生物組成進行測定, 共得到了41門的物種, 其中變形菌門、藍藻門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門及熱微菌門是主要組分, 它們在四個尾礦庫的結皮中累計豐度達到90%以上, 說明結皮與土壤中微生物類群存在一定同源性。但是兩者優勢類群豐度存在一定差異, 本研究中結皮的優勢類群為變形菌門和藍藻門, 兩者在結皮中的平均相對豐度分別為43%和11%, 放線菌門和酸桿菌門相對豐度較低, 在結皮中的平均相對豐度分別為9%和7%。而在健康土壤中, 變形菌門平均占土壤總細菌群落的39%, 酸桿菌門平均占20%, 放線菌門占13%[32]?？梢钥闯鲈诮Y皮和土壤中變形菌門均占據絕對優勢, 藍藻門取代了酸桿菌門優勢地位,成為結皮中第二大細菌組分。同樣有研究者發現銅陵銅尾礦庫廢棄地結皮的微生物群落中主要類群為變形菌門、藍藻門、擬桿菌門和酸桿菌門, 其中藍藻門在群落中相對豐度也較高, 與本研究的結果較為一致[33]。藍藻具有較強的環境適應性, 是生物土壤結皮得以拓殖和演替的基礎, 廣泛存在于各個發育階段的生物土壤結皮中。另外沙漠地區的生物土壤結皮微生物群落結構表現與尾礦庫結皮相似, 而沙漠結皮下流沙層的微生物群落結構則偏向于健康土壤, 這都說明了藍藻門在結皮的微生物群落結構中不可替代的地位[34]。藻類除了是生物土壤結皮的主要固氮生物和光合生物外, 藻絲體和分泌的胞外多糖的黏結作用也是固定土壤表皮, 增強土壤抵抗風水侵蝕能力的重要因素[35]。微生物Shannon和Simpson多樣性指數表現出與演替年代顯著的正相關(圖5), 表明結皮中微生物群落結構受到結皮發育年代和結皮演替階段的影響。

圖6 結皮中門水平Top10微生物的相對豐度Fig. 6 Relative abundance of the Top10 microorganisms at phylum level in crusts

4 結論

(1) 生物土壤結皮可在金屬尾礦庫中廣泛分布,同時可以起到增加尾礦庫土壤養分的作用, 隨著結皮的發育演替表層土壤的有機質、總氮和速效鉀含量均有所增加。(2) 高通量測定與分析表明結皮的微生物群落組成豐富, Top10的微生物在不同結皮中的累計豐度達均到90%以上。隨著結皮的演替, 其微生物多樣性有所增加。(3) 金屬尾礦庫中的生物土壤結皮物種組成及其變化規律與荒漠化地區類似, 且藍藻在其中具有不可替代的作用。

致謝:

感謝中國科學院水生生物研究所張云博士和鄭嬌莉博士在樣品采集和數據分析中給予的大力支持。