培養方式對纖細裸藻脂肪酸與氨基酸含量的影響

高金偉 張文慧 竇 勇 姜智飛, 賈旭穎 邵 蓬 周文禮

(1. 天津大學化工學院生物工程系系統生物工程教育部重點實驗室，天津 300350; 2. 天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津農學院水產學院，天津 300384; 3. 農業農村部漁業環境及水產品質量監督檢驗測試中心(天津)，天津 300221)

纖細裸藻(Euglena gracilis)屬于裸藻門、裸藻屬, 主要分布在陽光充足、有機質豐富、靜止無流水的小水體中[1], 在營養充足、天然原生態的環境中得以繁殖[2]。其營養方式為兼性營養[3], 既可以通過光合作用制造營養, 有效固定環境中的CO[4],2

又可以通過滲透營養來攝取有機物, 如牛肉膏、蛋白胨、醋酸鹽、乙醇等[5—8], 不同的營養方式對微藻代謝產物的種類與含量有較大的影響[9,10]。

纖細裸藻含有豐富的營養成分, 包括氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、裸藻糖和抗氧化成分(如β胡蘿卜素、維生素C、維生素E等), 富含59種人體必需的營養元素, 氨基酸種類尤其豐富, 含有人類所需的全部氨基酸。目前, 纖細裸藻在生物餌料應用方面的重要性逐漸被認識, 已被增補到《飼料原料目錄》中。但是, 對纖細裸藻代謝產物與環境互作機制這一問題的研究尚未見報道。

本文在此基礎上, 選取自養、異養、兼養、光誘導四種培養方式, 實驗室條件下研究了培養方式對纖細裸藻生長、脂肪酸、氨基酸的影響, 并探討了可能的作用機理, 為闡明纖細裸藻對不同培養方式的響應提供科學依據, 同時為其開發應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 微藻

纖細裸藻(Euglena gracilis)由天津農學院漁業資源與環境實驗室提供。

1.2 培養方法

自養培養纖細裸藻的光自養實驗在三角瓶中進行, 使用本實驗室配制的AF-6自養培養基進行培養, 培養溫度為(25±1)℃, 光照30 μmol/(m2·s),光暗比12 L∶12 D。每天搖瓶數次, 防止微藻細胞附壁或下沉。連續培養, 每5天擴培一次, 培養完成后進行濃縮干燥, 得到藻粉待用。

兼養培養纖細裸藻的兼養培養實驗在三角瓶中進行, 使用本實驗室配制的HUT異養培養基(KH2PO4: 0.02 g/L; MgSO4·7H2O: 0.025 g/L; 酵母抽提液: 0.4 g/L; 乙酸鈉: 0.4 g/L; 蛋白胨: 0.6 g/L)進行培養, 其他條件同自養培養。

異養培養將纖細裸藻在0.8%的瓊脂培養皿中劃線, 置于黑暗環境中篩選, 選擇在黑暗條件下生長狀況良好的裸藻細胞, 挑取并接入三角瓶中進行培養, 光照為0, 其他條件同上。

異養培養+光誘導(簡稱光誘導)在黑暗條件下纖細裸藻異養培養方法同上, 培養96h后, 將其轉入光照條件下光誘導48h, 溫度控制在25℃左右,連續光照30 μmol/(m2·s) 48h, 培養完成后進行濃縮干燥, 得到藻粉待用。

1.3 實驗方法

細胞密度與比生長速率μ的測定使用血球計數板測定藻細胞密度。

根據公式計算比生長速率μ[11]。

式中,X2為第二次取樣時(t2)的細胞密度;X1為第一次取樣時(t1)的細胞密度

細胞干重的測定取10 mL藻液, 分別稀釋8個梯度后測藻細胞密度, 然后將樣品置于烘箱中,105℃下烘干, 干燥后使用電子天平測定藻細胞干重,作細胞密度-干重的標準曲線(圖1), 計算藻細胞干重[12]。

圖1 藻細胞干重與密度的標準曲線Fig. 1 Curves of the relation between algal cell dry weight and cell density

脂肪酸組成分析甲脂化方法: 取樣品加入到15 mL離心管中, 加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液, 水浴回流至油滴消失。加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液, 繼續煮沸30min。加入適量異辛烷溶液, 移去冷凝管, 加入20 mL飽和氯化鈉溶液。吸取上層溶液1—2 mL, 加入無水硫酸鈉脫水, 進樣。

使用Agilent 7890A氣相色譜-質譜聯用儀進行分析, 所使用的色譜柱型號為CNW CD-2560, 規格為100 m×0.25 mm×0.20 μm。運行參數為: 進樣口溫度為250℃, 檢測器類型為FID, 檢測溫度為260℃,進樣量為1 μL, 分流比為10∶1, 載氣流速為0.5 mL/min。柱溫箱升溫程序如下: 溫度達到130℃后, 保持5min, 然后以4℃/min的速率升溫至240℃, 保持30min。

氨基酸含量測定取0.5 g藻粉于20 mL水解管中, 加入6 mol/L的鹽酸溶液16 mL, 真空脫氣30min, 充氮封管; 在110℃下水解22—24h后, 用去離子水無損轉移到50 mL容量瓶中定容; 取1 mL水解液于小瓶中, 真空脫酸抽干; 連續兩次加入1 mL蒸餾水后抽干, 備用; 加入0.02 mol/L鹽酸溶液1 mL,充分溶解后, 取500 μL置于5 mL的離心管中, 分別加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL, 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL混勻; 室溫放置1h后, 加入正己烷, 劇烈搖動, 放置10min; 取下層溶液, 用0.22 μm的水相濾膜過濾, 上機分析。

使用Agilent 1260液相色譜儀進行分析, 流動相A為乙腈(0.1 mol/L), 3%乙酸鈉溶液, pH為6.5。流動相B為80%乙腈水溶液。所使用的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠, 規格為4.6×250 mm×5 μm。運行參數為: 柱溫為40 ℃, 流速為1.0 mL/min, 檢測波長為254 nm, 洗脫梯度如表1所示。

表1 洗脫梯度Tab. 1 Elution gradient

1.4 數據統計

采用Excel 2003整理數據, 使用SigmaPlot10.0及Excel 2003繪制圖形, SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 設定顯著性水平為P＜0.05。

2 結果

2.1 四種培養方式對纖細裸藻細胞密度的影響

如圖2所示, 在0—48h四種培養方式下藻細胞均呈對數生長, 自養組纖細裸藻生長速度顯著低于其他三組(P＜0.05), 光誘導組與兼養組藻細胞生長最快, 明顯高于其他兩組(P＜0.05)。48h后, 異養組藻細胞密度開始下降, 顯著低于其他實驗組(P＜0.05)。生長至168h, 兼養條件下藻細胞密度、細胞干重和平均比生長率(表2)顯著高于其他組(P＜0.05), 密度達到1.27×106cells/mL, 細胞干重高達0.044 g/L; 自養組與光誘導組細胞密度、比生長速率均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 四種方式培養纖細裸藻細胞密度的變化Fig. 2 Effects of four culture methods on the cell density ofEuglena gracilis

表2 四種方式下纖細裸藻干重和細胞比生長速率結果對比Tab. 2 Dry weight and specific growth rate of Euglena gracilis grown by four culture methods

2.2 四種培養方式下纖細裸藻脂肪酸含量變化

表3列出了纖細裸藻在四種培養方式下脂肪酸種類, 自養組和兼養組纖細裸藻脂肪酸碳鏈組成均在C12—C22, 主要為油酸甲酯(C18∶1N9C)、反式亞油酸(C18∶2N6T)和α-亞油酸(C18∶3N3)等。其中,自養組纖細裸藻共含有21種脂肪酸, 其中飽和脂肪酸(SFA)7種, 主要為月桂酸(C12∶0)、銀杏酸(C13∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、十五碳酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、十七烷酸(C17∶0)和硬脂酸(C18∶0), 單不飽和脂肪酸(MUFA) 4種, 多不飽和脂肪酸(PUFA)10種。

兼養條件下共有19種脂肪酸, 飽和脂肪酸5種,主要為月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)和十八烷酸(C18∶0), 與自養組相比, 減少了銀杏酸(C13∶0)和十七烷酸(C17∶0)兩種, 單不飽和脂肪酸5種, 增加了反式油酸(C18∶1n9t); PUFA9種, 減少了二十二碳二烯酸(C22∶2n6)。

表3 在四種培養方式下纖細裸藻脂肪酸種類Tab. 3 The kinds of fatty acids in E. gracilis grown by four culture methods

異養組與光誘導組纖細裸藻脂肪酸碳鏈組成均在C8—C22之間, 與自養組和兼養組相比, SFA增加了3種, 分別為辛酸(C8∶0)、月桂酸(C10∶0)和十一烷酸(C11∶0)。異養組共含有29種脂肪酸組分,主要為肉豆蔻酸(C14∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1N9C)、花生四烯酸(C20∶4N6)和二十碳五烯酸EPA(C20∶5N3)等, 占總含量的58%以上, 其中SFA12種, MUFA8種, PUFA9種。光誘導組共含有28種組分, 主要為棕櫚酸(C16∶0)、油酸(C18∶1N9C)、亞油酸(C18∶2N6C)和α-亞油酸(C18∶3N3), 占總脂肪酸含量的60%以上, 其中SFA12種, MUFA6種,PUFA10種。

雖然四種培養方式下脂肪酸碳鏈組成相似, 但是脂肪酸含量與所占比例變化十分明顯。由表4和圖3可知, 脂肪酸組分含量由高到低依次為光誘導組、異養組、兼養組、自養組。在異養組中, 飽和脂肪酸占比例最高, 為49.29%, 其他三個實驗組均為多不飽和脂肪酸占比最高, 其自養組、兼養組和光誘導組占比分別為65.90%、68.08%和54.83%。

2.3 四種培養方式下纖細裸藻氨基酸含量變化

氨基酸自動分析儀對17種游離氨基酸進行檢測, 檢測結果如表5所示, 氨基酸種類略有差別, 在自養組和兼養組檢測出了半胱氨酸(Cysteine), 而在異養組和光誘導組未檢測出, 而在異養組和光誘導組檢測出了胱氨酸(Cystine), 在自養組和兼養組未檢出。游離氨基酸含量由高到低依次為: 光誘導組＞兼養組＞異養組＞自養組, 其中, 自養組主要為亮氨酸(LEU)、谷氨酸(GLU)和精氨酸(ARG), 占總量的39%; 異養組主要為谷氨酸(GLU)、精氨酸(ARG)和脯氨酸(PRO), 占34.7%; 異養組主要為亮氨酸(LEU)和谷氨酸(GLU), 占30.6%, 光誘導組主要為亮氨酸(LEU)、精氨酸(ARG)和脯氨酸(PRO), 占總量的30.5%。

四個實驗組中均檢測到7種必需氨基酸(EAA)：甲硫氨酸(MET)、纈氨酸(VAL)、異亮氨酸(ILE)、苯丙氨酸(PHE)、亮氨酸(LEU)、蘇氨酸(THR)和賴氨酸(LYS), 四個實驗組必需氨基酸含量由高到低為兼養組＞光誘導組＞異養組＞自養組, 含量分別為134.37、128.86、100.97和85.84 mg/g。實驗組EAA/TAA值均超過30%, 兼養組＞自養組＞光誘導組＞異養組, 占比分別為37.52%、37.15%、33.77%和30.58%, EAA/NEAA分別為0.6、0.59、0.51和0.44。

表4 四種培養方式下纖細裸藻脂肪酸含量Tab. 4 Grouping of E. gracilis grown by four culture methods based on fatty acids

3 討論

3.1 培養方式對藻細胞生長的影響

本研究發現, 纖細裸藻在異養培養后期, 細胞密度下降, 比生長速率僅為0.049/d, 李姿等[13]的研究中發現, 鈍頂螺旋藻異養培養后期藻密度也存在下降趨勢, 汪晶等[14]發現, 混養培養Syuechococcussp.時, 有機碳的存在會促進無機碳的利用。在異養條件下纖細裸藻細胞密度下降可能是因為沒有足夠的無機碳源滿足其生長的需要, 也可能與共生菌在異養條件下占優勢有關。

在實驗后期兼養條件下纖細裸藻生長最佳,說明兼養條件下纖細裸藻更能有效地積累生物量,李昌靈等的研究[15,16]表明, 兼養條件下培養小球藻與鈍頂螺旋藻也有同樣的規律, 在光暗條件轉換過程中, 纖細裸藻代謝方式可以快速由自養切換到異養[17]。

圖3 四種培養方式下纖細裸藻脂肪酸組分百分比疊加圖Fig. 3 Grouping of E. gracilis grown by four culture methods based on fatty acid percentages

3.2 培養方式對脂肪酸的影響

脂肪酸是指一端含有一個羧基的長的脂肪族碳氫鏈, 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)具有很高的營養價值和醫學價值。陸嘉欣[18]研究中顯示, 纖細裸藻(4d)碳鏈組成在C11—C22,飽和脂肪酸7種, 占比最高的為飽和脂肪酸。而在本研究中, 自養組和兼養組碳鏈組成在C12—C22,異養組和光誘導組在C8—C22, SFA種類增多, 均有12種。在本研究中, 除異養組占比最高的是SFA,其余三個實驗組占比最高的為PUFA, 其結果不一致的原因一方面可能是因為本實驗中纖細裸藻未經過誘變, 另一方面可能是因為培養基的不同導致代謝產物的差異。

3.3 培養方式對氨基酸的影響

在四種培養方式下, 纖細裸藻均含有17種氨基酸, 其中必需氨基酸占總氨基酸質量分數均大于30.5%。氨基酸含量兼養條件下最高, 比生長速率在此條件下也最高, 為0.214/d。在自養和兼養條件下纖細裸藻所有氨基酸種類相同, 異養和光誘導條件下氨基酸種類相同, 可能的原因為不同培養方式下碳利用方式和途徑不同導致纖細裸藻一些氨基酸代謝產生差異。

有學者曾測定石莼(Ulva lactucaL.)、麒麟藻(Eucheuma serra)、馬尾藻(Scagassum)、羊棲藻(Sargassum fusiforme)、海帶(Saccharina japonica)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、紫菜(porphyra)、滸苔(Euteromorpha)和龍須菜(Gracilaria lemaneiformis)氨基酸的含量[19], 研究顯示, 紫菜氨基酸的總含量最高, 為30.92 g/100 g, 除谷氨酸(Glu)外, 其他游離氨基酸含量均高于其他幾種藻類。而在本實驗中,四種培養方式下的纖細裸藻氨基酸含量遠遠高于紫菜含量, 自養組氨基酸含量最低, 達231.1 g/100 g,是紫菜氨基酸含量的7.47倍, 最高的光誘導組含量達到381.57 g/100 g, 是紫菜氨基酸含量的12.34倍。人體必需氨基酸的含量同樣遠高于紫菜, 是紫菜的7.50—11.74倍。

表5 四種培養方式下纖細裸藻氨基酸含量Tab. 5 Amino acid contents in E. gracilis grown by four culture methods

兼養組、自養組、光誘導組和異養組EAA/TAA值分別為37.52%、37.15%、33.77%和30.58%,EAA/NEAA分別為0.6、0.59、0.51和0.44, 除了兼養組, 其他組必需氨基酸含量與E/N值均略低于FAO/WHO(聯合國糧農組織/世界衛生組織)標準規定的必需氨基酸含量40%左右和E/N值0.6[20], 這是由于實驗過程中未檢測色氨酸(Try)。有研究顯示[21],蛋白核小球藻和橢圓小球藻的EAA/TAA值分別為38.05%和40.28%, E/N值分別為0.61和0.67, 本實驗中纖細裸藻兼養組和自養組EAA/TAA值和EAA/NEAA值略低于小球藻。董黎明等研究顯示, 異養培養的橢圓小球藻氨基酸組成品質更高[22], 本實驗中結果相反, 異養組纖細裸藻氨基酸品質比自養組和兼養組都低。

4 結論

光誘導培養可顯著提高纖細裸藻總脂肪酸、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量; 異養培養可顯著提高纖細裸藻飽和脂肪酸含量; 兼養培養可顯著提高纖細裸藻必需氨基酸含量。