小魚際滾法對組織機化期骨骼肌鈍性損傷家兔Fibronectin-1與CTGF-1表達的影響

艾玨萍 羅婷 吳安林 黃曉蒂 楊程 葉平 謝秀惠 彭亮

〔摘要〕 目的 觀察小魚際滾法對組織機化期骨骼肌鈍性損傷家兔纖連蛋白-1（fibronectin-1，FN-1）、結締組織生長因子-1（connective tissue growth factor，CTGF-1）表達的影響。方法 選取30只成年新西蘭大耳白兔，隨機均分為手法治療組、模型對照組、空白對照組，各10只。手法治療組予造模、治療處理，模型對照組予造模、不治療處理，空白對照組予不造模、不治療處理，采取自制重力鉛錘擊打兔右后下肢股四頭肌造成骨骼肌鈍性損傷模型，并在療程3 d后3組全處死，在兔股四頭肌受損區域內取肌肉組織，HE染色觀察組織形態的變化，Western-Blot檢測治療前后FN-1、CTGF-1的變化情況。結果 HE染色結果顯示：模型對照組與空白對照組對比，其模型對照組肌纖維受損較多，并有不規則結締樣組織填充其中;手法治療組與模型對照組對比，手法治療組新生的肌纖維及新生血管更明顯，炎性細胞較少，肌肉形態受損較輕。Western-Blot結果顯示：模型對照組FN-1、CTGF-1指標顯著高于空白對照組，手法治療組FN-1、CTGF-1指標均顯著高于空白對照組、低于模型對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 在組織機化期骨骼肌鈍性損傷模型家兔股四頭肌修復過程中，運用小魚際滾法治療，可有助修復受損的骨骼肌，使炎性細胞減少，促進骨骼肌新生，改善家兔運動功能，提高療效，值得推廣應用。

〔關鍵詞〕 骨骼肌;組織機化期;鈍性損傷;小魚際滾法;纖連蛋白-1;結締組織生長因子-1

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Interthenar rolling method on the expression of skeletal muscle blunt injury fibronectin-1 （Fibronecttin-1， FN-1） and connective tissue growth factor （CTGF-1） in rabbits with blunt injury of skeletal muscle in tissue mechanization stage. Methods A total of 30 adult New Zealand rabbits with big ears were randomly divided into a manual treatment group， a model control group and a blank control group， with 10 cases in each group. The manipulation treatment group was given model making and treatment， and the model control group was given modeling without treatment. The blank control group do not make model and treatment. A blunt injury model of skeletal muscle was made by hitting the rabbit's right lower limb quadriceps with a self-made homemade gravity lead hammer， and all the groups were sacrificed after 3 days of treatment. Muscle tissue was taken from the rabbit quadriceps damaged area， and HE staining was used for observing tissue morphological changes. The changes of Fibronectin-1 and CTGF-1 before and after treatment were detected by Western-Blot. Result The results of HE showed that compared with the model control group and the blank control group， the muscle fibers in the model control group were more damaged and serious than those in the manipulation treatment group， in which irregular connective tissue was filled. Compared with the manipulation treatment and model control group， the new muscle fibers and neovascularization in the manipulation treatment group were more obvious， and the inflammatory cells were fewer than those in the model control group. The results of Western-Blot showed that the indexes of FN-1 and CTGF-1 in the manipulation treatment group were significantly higher than those in the blank control group.The indexes of FN-1 and CTGF-1 in the manual treatment group were significantly higher than those of the blank control group and lower than those in the model control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion In the process of repairing quadriceps femoris in rabbits with blunt injury of skeletal muscle in organized phase， the method of interthenar rolling was used， which can help to repair the damaged skeletal muscle， to reduce inflammatory cells， to promote skeletal muscle regeneration， to improve the motor function of rabbits， and improve the curative effects. It is worthy of popularizing and applying.

〔Keywords〕 skeletal muscle; tissue mechanization period; blunt injury; interthenar rolling method; fibronectin-1; connective tissue growth factor-1

運動損傷中，骨骼肌損傷很常見，發生概率約10%～55%[1]，多由長期性耐力運動引起，其比較常見的損傷類型有鈍挫性、撕裂性及牽拉性等。骨骼肌損傷后發生炎性反應，局部瘢痕組織增生并纖維化，受損肌肉組織彈性漸漸喪失，伴有肌肉強硬、活動性能下降，肌電指標和生理生化指標改變，如果得不到及時康復治療，愈合期拖延，甚至遷延不愈，最終可能造成受損的肌組織功能喪失[2]或組織脆性增加，極易發生再次損傷。因此，充分研究骨骼肌損傷機制，探討怎樣減少肌肉纖維化，提高患者功能恢復及生活質量，是當今醫學研究領域中的一個重要課題。有前期實驗研究發現，肌成纖維細胞分化受多種細胞因子、信號通路的調控，力學因素幾乎影響著體內所有的細胞，細胞的生長、發育、增殖、死亡都和細胞的力學特性有關[3]。而既往研究已證明，力學因素對肌成纖維細胞分化有十分重要影響，細胞內的應力釋放可直接導致其凋亡[4-5]。因此，手法或許能減少肌成纖維細胞的增生，促進其凋亡，從而控制纖維化的進程[6-7]。臨床研究證實[8-10]，對骨骼肌纖維化疾患，推拿療法對肌成纖維增生具有干預作用，但大多研究的推拿在骨骼肌鈍性損傷早期的作用機制，未研究推拿在骨骼肌鈍性損傷組織機化期的作用機制。本研究運用小魚際滾法進行干預，觀察其對纖維連接蛋白-1（fibronectin-1，FN-1）、結締組織生長因子-1（connective tissue growth factor，CTGF-1）表達的影響，旨在確定在組織機化期小魚際滾法能否促進骨骼肌鈍性損傷后運動功能的恢復，以期為推拿臨床治療提供更優化的實驗依據。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

3月齡健康SPF級成年新西蘭大耳白兔30只，雌雄各半，由湖南中醫藥大學基礎研究所實驗動物中心提供。體質量252.41～320.67（315.71±22.98）g。飼養環境溫度20～25 ℃，濕度在50%～70%。適應性喂養7 d后，先隨機抽取空白對照組10只，余20只用自制重力鉛錘打擊裝置建立股四頭肌損傷模型后，按隨機數字表法均分為2組：模型對照組、小魚際滾法治療組（手法治療組），每組10只。

1.2? 主要儀器與試劑

蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達）;蛋白磷酸酶抑制劑（北京普利萊）;石蠟切片機（浙江金華）;標準電泳裝置（北京六一）;ZTC-II按摩手法測試儀（上海騰蔭教學儀器有限公司提供）;自制股四頭肌損傷模型打擊裝置[11]。

1.3? 模型制備

造模前1天，對兔右后肢進行剪毛處理。建模時，將家兔處仰位平置，捆綁固定，暴露股四頭肌和鄰近肌肉部位;以侯懿烜[11]自制重力錘直線下落擊打的造模方法為基礎進行改進，采取右后肢股四頭肌肌腹中段做打擊中心，先鋪一層紗布以防皮膚損傷;用自制重力鉛錘（錘長50 cm，重0.85 kg，底面平滑，直徑1.5 cm）沿PVC硬塑料導向管（長40 cm，直徑1.8 cm）自由下落（自由落高40 cm），同一部位連續打擊4次，以肉眼可察受打擊部位呈現腫脹及瘀血，類似肌肉受撞擊損傷，無皮膚受損、無骨折，觸碰兔子有躲避反射為準。5 d后模型建立成功（在預實驗過程中采用新西蘭大耳白兔14只，動物造模，測試鈍性損傷造模方法，于造模后第1、3、5、7、10、14、21天各隨機抽取2只，取股四頭肌肌肉組織，形態學觀察，實驗結果驗證第5天進入組織機化期表現）。

1.4? 治療方法

為保證每次手法操作標準化，在實驗操作前檢測手法數據，規范手法操作參數。實驗手法操作人員應為針灸推拿學專業研究生，根據標準滾法參數，在ZTC-II按摩手法測試儀上測試并訓練實驗手法操作人員達標，并在實驗動物股四頭肌進行練習，每天2次，每次操作練習3 min，總練習時間>30 min/d，連續練習3 d。

造模后第5天開始小魚際滾法治療，對手法治療組家兔進行捆綁局部小魚際滾法治療，全程手法操作要求保持兔子情緒相對穩定狀態，防止應激情況出現，以免影響實驗結果。若行手法過程中家兔亂動、亂叫可待其安靜后繼續施予小魚際滾法，空白對照組和模型對照組捆綁后不做其他處理。

具體操作手法：先將家兔固定于實驗臺處仰臥位，暴露股四頭肌和鄰近肌肉部位，以小魚際吸附于體表施術部位實施滾法，前后滾時著力輕重比為3∶1，峰值壓力為500 g重力，操作頻率為140次/min。每次操作5 min，每天上午、下午共2次，共治療3 d。

1.5? 取材及檢測

1.5.1? HE染色? 先烤片，再用石蠟切片機切片置于二甲苯中，然后梯度酒精脫水;染色，再梯度酒精脫水;最后取出后置于二甲苯，中性樹膠封片、顯微鏡觀察并采集圖像。

1.5.2? Western-Blot檢測骨骼肌勻漿中FN-1、CTGF-1蛋白表達量? 取骨骼肌組織，放入容器中密封并凍存于-80 ℃冰箱，剪取0.030 g組織，加入400 ？滋L RIPA裂解液反復研磨組織直至看不見組織塊，冰上裂解（10 min），4 ℃離心（15 min），將上清液轉移到1.5 mL的離心管中，并測定蛋白濃度，取30 ？滋g蛋白上樣，電泳，轉膜，封閉，敷抗體，顯影。檢測骨骼肌勻漿中FN-1、CTGF-1蛋白表達情況，以GAPDH為內參照蛋白，重復3次。

1.6? 統計分析

統計學處理數據應用SPSS 24.0統計軟件進行分析。計量資料采用“x±s”表示：符合正態分布，采用單因素方差分析并進行多重比較;不符合正態分布，采用Kruskal-Wallis H檢驗并進行多重比較。均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 組織學觀察

HE染色觀察由圖1可見：空白對照組兔股四頭肌肌纖維大小較均一，形狀、分布較整齊，未見結締樣組織;模型對照組受損部分肌纖維較多受損扭曲、崩解、變性，分布較松散，不規則的結締樣組織填充其中，變性壞死肌纖維束周邊有較明顯的纖維樣組織增生包裹，可察炎性細胞浸潤、少許自然恢復或新生的肌纖維及新生血管;手法治療組肌纖維形狀維持較好，肌纖維較粗，分布較緊密，可見炎性細胞浸潤較少及自然恢復或新生的肌纖維，與空白對照組對比還是可以觀察到少量的結締樣組織，與模型對照組對比，新生血管更明顯，組織病理結構更接近正常組織。

2.2? FN-1和CTGF-1蛋白質印跡結果

由圖2和表1可見，在損傷手法治療后，與空白對照組相比，模型對照組和手法治療組在FN-1和CTGF-1的表達水平均上升，差異有統計學意義（P<0.05）;模型對照組與手法治療組的FN-1、CTGF-1表達水平比較，模型對照組兩種蛋白水平均高于手法治療組，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

中醫學中，骨骼肌損傷屬于“筋傷”范圍。《說文解字·筋部》：“筋，肉之力也……竹，物之多筋者?！敝?，是含纖維較多的物質;肉，即為肉體。肉、竹、力合起來，即纖維組織，為人體產生力量。肌肉收縮及神經沖動靠的是人體產生力量，因此，從現代意義看，《內經》中所指的筋就是肌肉和神經[12]?！墩w類要》謂：“肢體損于外……臟腑由之不和。”[13]俗語“傷筋動骨”則說明傷筋會影響骨骼。在骨折的同時也會有筋傷，兩者緊密相連。故筋絡骨，骨連筋，二者相互協同，才能保證人體關節的正?；顒?。而傳統推拿理論認為[14]推拿具有舒經通絡、活血化瘀、消腫止痛、放松肌肉、滑利關節等作用?，F代醫學認為在人體的關節、肌肉、韌帶、肌腱、鞘膜等特定部位，推拿通過手法可刺激受損肌組織及相鄰部位的經絡，或經過神經反射調節機體生理、病理狀態以達到治療效果[15-16]，同時利用力學原理，推拿可糾正關節移位、錯位，使脊柱、軀干、四肢得以維持其正常形態。這些都證明在骨骼和肌肉損傷康復治療方面，推拿治療具有獨特優勢。

骨骼肌鈍性損傷組織機化期受到各類生長因子的調節，激活的肌衛星細胞除部分負責自我更新外，大部分將轉化為具有增殖分化能力的成肌細胞，通過相互融合或與損傷殘留的肌纖維融合重建肌組織，以組織增生修復為主。因此，組織機化期骨骼肌鈍性損傷期應以活血化瘀、理筋整復手法為主。臨床研究進展表明，推拿滾法在臨床上應用廣泛，尤以治療頸肩、腰部、肌肉運動損傷等方面臨床報道較多。近年來[18]，滾法被廣泛引用，屬推拿手法中頻繁使用的手法之一，不僅能擴張血管、促進推拿部位血液循環與淋巴循環，加快血氧代謝，改善微循環，從而達到祛瘀生新[19-21]作用。而且能減少炎性滲出，減少或預防粘連，促進滲出液吸收、壞死組織清除，加快受損組織損傷修復[22-24]。

本實驗手法治療組經小魚際滾法治療后，通過HE染色觀察可見，手法治療組肌纖維形狀維持較好，炎性細胞浸潤較少且有新生的肌纖維。與模型對照組對比，新生血管更明顯，組織病理結構更接近正常組織，說明通過小魚際滾法治療，能減少肌成纖維細胞的增生，促進肌纖維的恢復、增強血管新生、減少骨骼肌機化，功能上可有助受損的骨骼肌修復。通過WB結果顯示，模型對照組和手法治療組中FN-1、CTGF-1蛋白表達量比空白對照組高，手法治療組對比模型對照組FN-1和CTGF-1的蛋白表達水平相對較低。其Fibronection[25]（FN）起調節細胞遷移、生長、分化，維持組織形態的作用。而[26]CTGF-1具有誘導橫向分化成肌細胞，促細胞增殖、黏附、趨化及調節細胞外基質的能力。因此我們可以推斷，說明在使用小魚際滾法治療可抑制FN-1、CTGF-1蛋白的表達，在損傷后小魚際滾法能減少肌成纖維細胞的增生，維持肌纖維形態、增強血管新生、減少骨骼肌機化，抑制瘢痕組織形成，對骨架形態恢復起一定作用。減少肌纖維生成，抑制組織機化。并結合動物形態學觀察可見，擊打部位腫脹及淤血減退，較模型對照組明顯減輕，觸碰兔子無躲避反射，活動情況（如跳躍、吃食）較模型對照組更自如。

因此，小魚際滾法對家兔股四頭肌損傷修復進行實驗研究發現：小魚際滾法能促進肌肉修復有關的基因表達，可能與修復作用有關。運用小魚際滾法對組織機化期骨骼肌鈍性損傷介入治療，提示了與運動損傷后功能障礙有密切關系，對推拿臨床治療有著重要指導作用，值得推廣應用。

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