寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎的活性成分、靶基因篩選和生物學功能分析

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，季志紅，艾尼瓦爾·吾買爾，買爾旦·玉蘇甫，周文婷*

1新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830011；2新疆醫科大學維吾爾醫學院；3新奇康藥業股份有限公司

寒喘祖帕顆粒是新疆中醫藥-民族醫藥之一，由小茴香、芹菜子、神香草、玫瑰花、蕓香草、蕁麻子、鐵線蕨、胡蘆巴和甘草浸膏等9味藥材組成，載于中華人民共和國衛生部藥品標準維吾爾藥分冊，其功效是鎮咳、化痰、溫肺止喘[1～2]。臨床研究[3～6]報道，寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎能快速緩解臨床癥狀，提高治療有效率。寒喘祖帕顆粒作為復方，其藥味多、成分較多、藥理作用復雜，目前寒喘祖帕顆粒作用于毛細支氣管炎的藥理作用機制尚未系統闡明。網絡藥理學是新藥發現的先進途徑，可系統地解釋藥物對疾病的作用機制。2019年10月～2012年12月，本研究通過網絡藥理學方法系統地揭示寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎的活性成分及活性成分靶基因，探討寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎靶基因的生物學功能及相關信息通路。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件 TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，整合Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD 三大數據庫的蛋白質綜合數據庫)； Uniprot數據庫。DAVID(版本：6.8)數據庫(https://david.ncifcrf.gov/，是全面提供功能注釋、可視化和集成發現的工具)。DiSGeNET(http://www.disgenet.org/)CTD(http://ctdbase.org/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca)數據庫。String(版本：11.0)數據庫(https://string-db.org，搜索已知蛋白和預測蛋白之間相互作用的系統)。PubChem數據庫(包括有機小分子生物活性數據的及化學模組的數據庫)。PDB數據庫(https://www.rcsb.org，是蛋白質、多糖、核酸、病毒等生物大分子的三維結構的數據庫)。Cytoscape(版本：3.7.1，是一款圖形化顯示復雜網絡并進行分析和編輯的軟件)。

1.2 寒喘祖帕顆粒藥材活性成分的篩選、活性成分靶基因的預測及藥材—活性成分—靶基因網絡構建 通過TCMSP數據庫收集寒喘祖帕顆粒9味藥材的化學成分。收集所得的所有化學成分通過藥物口服生物利用度(OB)、Caco-2 細胞滲透性、血腦屏障(BBB)等ADME參數的限制對其中可能的活性成分進行篩選、分析。寒喘祖帕顆粒9味藥材活性成分的篩選標準參照文獻[7～8]：OB≥30、BBB≥0.3、Caco-2≥-0.4為藥物的生物活性成分。

找到寒喘祖帕顆粒藥材生物活性成分后，通過TCMSP數據庫收集寒喘祖帕顆粒9味藥材活性成分對應的靶基因。然后，將所有靶基因通過Uniprot數據庫以“Homo sapiens”(人屬)為關鍵詞進行基因—蛋白名稱轉化，即將全部蛋白名稱轉換為基因名稱。并將寒喘祖帕顆粒的藥材、活性成分和靶基因通過Cytoscape3.7.1軟件構建藥材—活性成分—靶基因網絡圖(HB-cC-cT Network)。網絡拓撲參數自由度(Degree)代表在蛋白相互作用網絡中與該節點直接相互作用的節點的數目。節點的大小與度數成正比。節點的度越大則其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強[9]。

1.3 毛細支氣管炎發病相關靶基因的篩選及藥物-疾病共同潛在靶基因的篩選 以 “Bronchiolitis” 作為關鍵詞，對4大常用數據庫(包括CTD、TTD、DiSGeNET、DrugBank)進行已知的毛細支氣管炎發病相關靶基因的檢索及篩選，并刪除檢索結果中重復的靶基因，獲得毛細支氣管炎發病過程已知的靶基因。然后將毛細支氣管炎的發病相關靶基因通過String數據庫進行蛋白—蛋白相互作用分析。對置信度(Score)得分設定閾值，對蛋白相互作用進行篩選[10]。以Score≥0.9和“Human Sapiens”為關鍵詞篩選得到毛細支氣管炎發病相關的主要靶基因，并構建成蛋白—蛋白相互作用的網絡圖。將毛細支氣管炎發病相關主要靶基因與寒喘祖帕顆?；钚猿煞职谢蜻M行交集，得到藥物-疾病共有的潛在靶基因，并用Cytoscape3.7.1軟件構建藥材-潛在成分-潛在靶基因網絡圖(HB-pC-pT Network)。

1.4 寒喘祖帕顆粒—毛細支氣管炎共同潛在靶基因生物學功能及信號通路分析 將寒喘祖帕顆粒-毛細支氣管炎共同潛在靶基因通過DAVID數據庫進行GO基因功能(P≤0.01)和KEGG通路分析(FDR，錯誤發現率≤0.01)。P值和FDR在富集分析中越小，代表富集顯著程度越高。

2 結果

2.1 寒喘祖帕顆粒9味藥材的成分、活性成分及活性成分靶基因、藥材-活性成分-活性成分靶基因網絡 寒喘祖帕顆粒的9味藥材收集到240個成分，分別為甘草115個、玫瑰花42個、小茴香26個、葫蘆巴12個、蕓香草12個、神香草12個、芹菜籽8個、蕁麻子7個和鐵線蕨6個。將240個成分以OB≥30、BBB≥0.3、Caco-2≥-0.4為標準進行篩選得到14個可能的活性成分，分別為β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)、檸檬烯(Limonene)、咖啡酸(Caffeic acid)、β-胡蘿卜素(Beta-carotene)、山奈酚(Kaempferol)、茴腦(Anethole)、HEX、Heptan、(L)-alpha-Terpineol、3-methylhexane和齊墩果酸(Oleanolic acid)，詳見表1。

表1 寒喘祖帕的可能活性成分

14個活性成分對應385個相關靶基因，刪除重復的靶基因名稱后得到197個靶基因。藥材、活性成分和靶基因之間的關系網絡由220個節點(9個藥材、14個活性成分和197個活性成分靶基因)和419個邊緣組成。從靶基因角度分析，PTGS2(Prostaglandin G/H synthase 2)、NCOA2(Nuclear receptor coactivator 2)、CASP3(Caspase-3)、JUN(Transcription factor AP-1)、CASP9(Caspase-9)、PTGS1(Prostaglandin G/H synthase1)、HSP90AA1(Heat shock protein HSP 90 alpha)、GABRA1(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1)、CHRM1(Muscarinic acetylcholine receptor M1)和HMOX1(Heme oxygenase 1)等靶基因的Degree比較大。從成分角度分析，槲皮素(degree=143)、山奈酚(degree=59)、木犀草素(degree=54)、β-谷甾醇(degree=36)和β-胡蘿卜素(degree=22)等成分的節點度比較大。

2.2 毛細支氣管炎發病相關的特異性靶基因及藥物-疾病共有潛在靶基因 CTD、TTD、DrugBank、DiSGeNET分別檢索到377、0、2、65個毛細支氣管炎發病過程中相關的靶基因，刪除重復靶基因，共檢索到419個已知的毛細支氣管炎發病相關的靶基因。String數據庫篩選得到214個毛細支氣管炎發病相關特異性靶基因。將214個疾病特異性靶基因與靶基因進行交集，得到50個寒喘祖帕顆?！氈夤苎坠灿械臐撛诎谢颉?/p>

2.3 寒喘祖帕顆?！氈夤苎准膊」灿袧撛诎谢?寒喘祖帕9味藥材的8個潛在成分作用于50個毛細支氣管炎發病相關特異性靶基因。50個潛在毛細支氣管炎發病相關特異性靶基因中VEGF、BCL2、TNF、IL2、TGFB1、HMOX1、MMP2、CASP3、RELA、NFKB1A等靶基因可能是寒喘祖帕顆粒發揮治療毛細支氣管炎作用的潛在靶基因。HB-pC-pT網絡見圖1。

注：八角形代表9味藥材；四角形代表8個潛在成分；圓形代表50個潛在靶基因

圖1 HB-pC-pT 網絡圖

2.4 寒喘祖帕顆粒-毛細支氣管炎共同潛在靶基因生物學功能及信號通路 50個寒喘祖帕顆粒-毛細支氣管炎共同潛在靶基因 GO基因功能分析結果顯示，前10個基因功能包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、免疫反應、凋亡過程、ERK1和ERK2級聯的正調節、體液免疫反應、上皮細胞增殖的正向調節、炎癥反應的陽性調節、蛋白質磷酸化、細胞因子分泌的正向調節。

共收集21條主要信號通路。包括HIF-1信號通路、TNF信號通路、cAMP信號通路、NOD樣受體信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB 信號通路、T和B細胞信號通路、P53信號通路、細胞凋亡、Jak-STAT信號通路、FoxO信號通路、RIG-I樣受體信號通路、MAPK信號通路和Toll樣受體信號通路等15條與產生炎性免疫反應有關的信號通路，催乳素信號通路、神經營養素信號通路、鞘脂信號通路、趨化因子信號通路、雌激素信號通路和GnRH信號通路等6條神經、內分泌相關的通路。其中NF-κB信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll 樣受體信號通路、JAK/STAT信號通路、FoxO信號通路、NOD 樣受體信號通路等7條信號通路與毛細支氣管炎密切相關。

3 討論

毛細支氣管炎是常見的兒童下呼吸道感染，由病毒感染引起的，最常見的病原體為呼吸道合胞體病毒(RSV)[11]。RSV病毒通過破壞氣道上皮細胞間緊密連接，促進黏膜蛋白的分泌，影響氣道上皮細胞的屏障功能[12]。氣道上皮細胞間的頂端連接復合物與其表面的黏液層構成了抵御病原微生物入侵的屏障。參與黏附連接的主要有上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、β- 連環蛋白(β-catenin)及α-連環蛋白(α-catenin)[13]。

為尋找寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎活性成分、靶基因，本研究采用網絡藥理學方法，通過TCMSP數據庫[TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)為公開的中藥系統藥理學數據庫與分析平臺]篩選寒喘祖帕顆粒的活性成分及其靶基因，同時通過CTD、TTD、DiSGeNET、DrugBank (收集了多種疾病相關基因的數據庫)等四大疾病數據庫收集毛細支氣管炎相關靶基因，收集寒喘祖帕顆粒-毛細支氣管炎共同的潛在靶基因，構建寒喘祖帕顆粒藥材-潛在活性成分-潛在靶基因網絡，找出了寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎活性成分、靶基因，并采用生物信息學分析了靶基因的生物學功能。

網絡藥理學研究結果表明，寒喘祖帕顆粒中的活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、咖啡酸、茴腦和齊墩果酸等在網絡中節點度比較大，意味著參與的生物功能多，其生物學重要性越強，是寒喘祖帕顆粒治療毛細支氣管炎的潛在成分。RSV感染氣道上皮細胞后下調E-cadherin的表達，致緊密連接相關蛋白易位，導致氣道黏膜屏障功能受損。最新研究[14]報道證明，VEGFR磷酸化和TGF-β1是導致E-cadherin介質的屏障功能受損的重要因素。其中TGF-β1是誘導上皮細胞向間充質細胞轉分化過程的關鍵靶基因[15]。研究[16]證明，山奈酚抑制TGF-β1mRNA 的表達，槲皮素抑制 TGF-β1誘導下A549細胞 E-cadherin的表達[17]，木犀草素對肝纖維化進程中TGF-β1誘導的肝細胞上皮間質轉化有抑制作用[18]。而VEGF是表皮生長因子受體，可參與上皮細胞的生長、修復和瘤變，在黏蛋白的分泌、細胞間緊密連接的調控中起重要作用[19～20]。最新研究[14]報道，RSV感染氣道上皮細胞可活化VGFR，下調氣道上皮細胞緊密連接相關蛋白E-cadherin的表達，從而破壞氣道黏膜的屏障功能。由此推測，寒喘祖帕顆粒的潛在成分主要阻止RSV與氣道上皮細胞的E-cadherin結合，從而在毛細支氣管炎治療中發揮關鍵作用。

毛細支氣管炎與哮喘免疫學發病機制相似，主要是細胞因子的變化，即細胞因子趨化內皮細胞在肺部聚集使之激活并釋放炎癥介質和病毒蛋白損傷氣道黏膜上皮，導致呼吸困難及喘憋[21]。研究[22]報道，血清中可溶性IL-2受體升高，使T細胞和NK細胞活性受阻，對RSV的清除能力降低。由此推測，寒喘祖帕顆粒可能通過IL-2對毛細支氣管炎癥反應過程產生影響。

NF-κB信號通路和MAPK參與氣道上皮細胞高分泌與炎癥反應。Toll 樣受體信號通路與RSV誘導氣道炎癥相關[23]。JAK/STAT信號通路和FoxO信號通路調控氣道黏蛋白高分泌[24～25]。NOD 樣受體信號通路和TNF信號通路與毛細支氣管炎氣道炎癥反應的發生有關[26]。研究發現，TLR4/NF-κB信號通路的激活在氣道上皮細胞炎癥反應中發揮重要作用，而槲皮素可以通過下調氣道上皮 TLR4/NF-κB 表達，減輕氣道的炎癥反應。β-谷甾醇能夠抑制炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，且可以下調NF-κB信號通路的活化[27]。本研究結果表明，以上的NF-κB、MAPK、JAK/STAT、FoxO、TNF和NOD 樣受體信號通路均符合FDR≤0.01，這與前期報道相符合。

綜上所述，寒喘祖帕顆粒9味藥材共收集到14個活性成分β-谷甾醇、槲皮素等及197個活性成分靶基因，寒喘祖帕顆粒-毛細支氣管炎共有的潛在靶基因50個。藥物疾病共有潛在靶基因主要參與炎癥反應、免疫反應、凋亡過程等生物學功能，主要信號通路有JAK/STAT信號通路、NOD 樣受體信號通路和TNF信號通路等。寒喘祖帕顆粒的槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素、咖啡酸、茴腦和齊墩果酸等活性成分可能作用于TGF-β1、VGFR、TNF-β、IL-6、IL-2，抑制氣道黏膜上皮細胞屏障和肺內炎癥介質的釋放而發揮治療毛細支氣管炎的作用，但其具體的藥理作用仍需要通過臨床實驗進行驗證。