吲哚-3-甲醇灌胃對小鼠變應性鼻炎治療作用觀察

郝婷婷，倪偉，魯海濤，李琳蕓

1 長江大學醫學院，湖北荊州 434000；2 長江大學第二臨床醫學院

變應性鼻炎(AR)是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病之一，是機體接觸變應原后主要由IgE 介導的鼻黏膜變態反應性疾病，主要癥狀有鼻阻、鼻癢、陣發性噴嚏及流清涕等[1]。AR是 Th1/Th2 型免疫應答失衡型炎癥反應，其免疫病理學特征是鼻黏膜組織中大量表達 Th2 型細胞因子(IL-4，IL-5，IL-18)的細胞浸潤[2]。近年AR發病機制不僅限于Th1/Th2細胞調節不平衡模式，現有研究發現，Tregs/Th17調節不平衡模式也是AR發病機制之一[3]。腸道微生物群可調節小腸固有層中輔助性T17細胞與T調節細胞之間的平衡[4]。腸道微生物群對AR影響的研究越來越多。色氨酸是一種營養必需氨基酸，具有促進腸蛋白合成和調節緊密連接蛋白和腸轉運蛋白表達的作用，以促進人和動物的腸黏膜屏障功能[5]。色氨酸細菌代謝主要代謝產物是吲哚類。Narendra等研究[6]發現，膳食吲哚能通過調節microRNA誘導促炎Th17細胞向抗炎Tregs轉變，從而抑制遲發性超敏反應。吲哚-3-甲醇(I3C)是否對AR有治療作用目前并無文獻報道，2018年8月～2019年12月，本研究觀察了色氨酸代謝產物I3C灌胃對AR小鼠的治療作用，并探討了其作用機制，為AR的治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器 動物：BALB/c小鼠，鼠齡5～8周，來自三峽大學動物中心，小鼠均為SPF級別，并在三峽大學實驗動物中心進行 SPF 級別環境飼養，小鼠飼料均為 SPF 級別。試劑：卵清蛋白(OVA)和I3C、ANTI-MOUSE FOXP3 PE、MOUSE IgG2a、ANTI-MOUSE IL-17AF PE、ANTI-MOUSE CD4 FITC均購于Singma公司。儀器:高速冷凍離心機購自德國 Eppendorf 公司；石蠟包埋機、組織冰凍機、石蠟切片機、顯微鏡購自德國Leica公司；流式細胞儀購自廣州譽維生物科技儀器有限公司； 渦旋振蕩儀購自金壇市醫療儀器廠；高壓蒸汽滅菌鍋購自上海博訊實業有限公司。

1.2 動物分組、AR動物模型的建立及I3C灌胃 將BALB/c小鼠隨機分成6組：干預1組、干預2組、干預3組、干預對照組、模型組、正常組。干預組、干預對照組、模型組小鼠腹腔注射0.05 mg OVA及5 mg AL(OH)3加入1 mL生理鹽水混勻，隔天1次，連續7次。第15天開始激發試驗，以5% OVA溶液雙側鼻腔點鼻，0.02 mL/側，1次/d，連續7次[7，8]。正常組用等量的生理鹽水處理。干預1、2、3組建模成功后用不同濃度的I3C 0.8、0.4、0.2 mg/d混合在橄欖油與無水乙醇(橄欖油：無水乙醇=4∶1)中灌胃，0.05 mL/只，干預對照組建模成功后用等量橄欖油和無水乙醇灌胃，1周后觀察小鼠行為學，處死后檢測相關指標。正常組和模型組建模成功后觀察小鼠行為學表現，15 min后處死小鼠，檢查相關指標。

1.3 各組臨床癥狀及組織病理觀察 最后一次鼻腔激發后觀察小鼠15 min，觀察小鼠鼻部癥狀，如噴嚏、流涕、抓癢等行為及嚴重程度，進行評分[9]。AR評分標準為末次激發致敏15 min內，對小鼠噴嚏個數、鼻腔分泌物量、抓鼻次數進行統計及評分。①噴嚏：1～3個計1分，4～10個計2分，11個及以上計3分；②流涕：前鼻孔有分泌物計1分，鼻分泌物超過前鼻孔計2分，面部布滿鼻分泌物計3分；③抓鼻：輕微搔鼻幾次計1分，雙爪反復搔鼻計2分，搔鼻面部不止，四處摩擦計3分。總分>5分，建模成功。

將小鼠鼻前部組織用4%多聚甲醛固定，多層脫水后制作石蠟切片，進行HE染色，觀察組織病理學變化。

1.4 各組外周血Tregs、Th17細胞及血清IL-10、IgE的檢測 外周血中Tregs、Th17細胞的檢測采用流式細胞術。取小鼠眼球全血后加入紅細胞裂解液，獲取沉淀的白細胞，隨后加入CD4+抗體，避光孵育30 min，洗滌后加FOXP3固定/破膜工作液，避光孵育18 h，再經過透化液、破膜液洗滌后，加入FOXP3抗體避光孵育以后，流式細胞檢測儀檢測Tregs。而同樣加入CD4+抗體后，加入IC固定液固定細胞后，加入IL-17抗體避光孵育20～60 min后，流式細胞檢測儀檢測Th17。血清IL-10、IgE的檢測采用ELISA 法。小鼠眼球取血，將取出血液靜置2 h左右，1 500 r/min離心，吸取上清后，嚴格按照ELISA試劑盒步驟操作，檢測血清IgE、IL-10。

2 結果

2.1 各組癥狀評分及病理學表現比較 干預1組、干預2組、干預3組、干預對照組、模型組、正常組癥狀評分分別為(1.67±0.82)、(1.75±0.71)、(1.71±0.76)、(7.80±0.84)、(7.29±1.11)、(1.08±0.84)分。與正常組比較，模型組、干預對照組癥狀評分升高(P均<0.05)。 與模型組比較，干預1、2、3組癥狀評分降低(P均<0.05)。干預對照組、模型組比較，P>0.05。干預1組、干預2組、干預3組組間兩兩比較，P均>0.05。正常組鼻前部組織結構完整，上皮細胞排列整齊，無明顯的炎性細胞浸潤。模型組和干預對照組鼻前部組織結構紊亂，間質見充血及增生，見大量炎性細胞增生。干預1組、干預2組、干預3組的小鼠與正常組小鼠鼻前部組織一樣，見少許散在炎性細胞，較對照組和模型組明顯減少。各組鼻前部組織病理表現見圖1。

注：A為正常組,無明顯炎性細胞； B為建模組，C為干預對照組，鼻腔黏膜見明顯炎性細胞浸入，圖中箭頭所指為炎性細胞；D、E、F分別為干預1組、干預2組、干預3組,黏膜見少許散在炎性細胞。

圖1 各組鼻前部組織病理變化(HE染色，200×)

2.2 各組Tregs、Th17細胞所占百分比及血清IL-10、IgE水平比較 干預1組、干預2組、干預3組、干預對照組、模型組、正常組Tregs所占百分比分別為1.48%±0.56%、1.95%±0.58%、1.46%±0.46%、0.36%±0.15%、0.27%±0.10%、1.51%±0.40%，Th17細胞所占百分比分別為0.54±0.14、0.66±0.09、0.37±0.24、1.20±0.20、1.46±0.41、0.46±0.16。與正常組比較，模型組、干預對照組Tregs所占百分比降低、Th17細胞所占百分比升高(P均<0.05)。與模型組比較，干預1、2、3組Tregs所占百分比升高、Th17細胞所占百分比降低(P均<0.05)。干預對照組與模型組Tregs、Th17細胞所占百分比比較，P均>0.05。干預1、2、3組之間Tregs、Th17細胞所占百分比兩兩比較，P均>0.05。

干預1組、干預2組、干預3組、干預對照組、模型組、正常組IL-10分別為(49.94±6.22)、(43.86±7.43)、(48.54±7.66)、(31.32±8.63)、(37.66±7.11)、(55.31±8.09)pg/mL，血清IgE分別為(293.03±41.61)、(280.03±58.48)、(259.74±58.66)、(400.36±61.36)、(343.63±57.59)、(217.66±56.14 )ng/mL。與正常組比較，模型組、干預對照組血清IL-10水平降低、IgE水平升高(P均<0.05)。與模型組比較，干預1、2、3組血清IL-10水平升高、IgE水平降低(P均<0.05)。干預對照組與模型組血清IL-10、IgE水平比較，P均>0.05。干預1、2、3組之間IL-10、IgE水平兩兩比較，P均>0.05。

3 討論

隨著社會發展、環境變化以及人類飲食的改變，微生物的免疫刺激與特應性反應類型存在聯系。此外，人類的營養也發生了很大變化，腸道與免疫之間的關系越來越被關注。AR的發生與腸道內色氨酸的細菌代謝產物關系越來越密切。益生菌已經被證實可以預防和改善消化系統疾病，如急性、醫院和抗生素相關腹瀉；過敏性疾病，如特應性皮炎(濕疹)和嬰兒變應性鼻炎。而腸道內色氨酸的細菌代謝產物也能影響菌群的改變，可能也有跟益生菌類似作用。

本研究中我們觀察到模型組小鼠在癥狀評分和IgE的表達上都明顯高于正常組，說明用OVA及氫氧化鋁佐劑腹腔注射滴鼻致敏小鼠能建立良好的AR動物模型。進一步研究觀察到模型組較正常組Th17細胞百分比升高，Tregs百分比降低，證實Tregs/Th17失衡是AR發病的重要因素。Huang等[10]通過檢查6例健康者和14例AR患者血液中Tregs和Th17細胞所占百分比，發現AR患者中Tregs百分比明顯低于健康者，而Th17細胞百分比明顯高于健康者。由此可知，AR的發生與Tregs/Th17調節平衡存在相關聯系。國外相關研究[11]證實，AR患者血清IL-17表達水平與臨床癥狀嚴重程度呈正相關。本研究中模型組較正常組外周血中IL-10水平明顯下降，其原因是Tregs有分泌IL-10的功能，在模型組Tregs細胞減少，IL-10分泌也減少。IL-10是一種重要作用的抗炎因子，能下調單核細胞表面的主要組織相容性抗原的表達，進而降低抗原呈遞作用，在變態反應中該物質可以調節效應細胞，參與免疫耐受維持作用[12]。因此，在AR患者中Tregs/Th17失衡而導致IL-10分泌減少可能是發病一個重要因素。

在我們用I3C對建模成功的小鼠進行干預后， I3C干預的小鼠癥狀評分及外周血液中IgE明顯低于干預對照組及模型組，同時在各組小鼠鼻前部組織黏膜病理變化中，也發現干預組鼻腔黏膜炎癥細胞少于干預對照組及模型組，說明I3C對AR可能是有一定的治療作用。進一步研究發現，干預各組小鼠外周血中Tregs百分比較干預對照組和模型組明顯增高，與干預對照組比較，干預組Th17細胞百分比下降，血清IL-10上升。推測I3C是通過調節Tregs/Th17，影響IL-10的分泌，從而對AR起到了治療作用。而干預1、2、3組各組之間的IgE、IL-10以及Tregs、Th17細胞比較差異無統計學意義，提示一定范圍內不同濃度的I3C對IgE、IL-10以及Tregs、Th17細胞的影響差異性不大。

總之，I3C可能通過增加Tregs百分比和降低Th17細胞百分比來調節AR小鼠血液中的Tregs/Th17平衡，減少IgE分泌、增加IL-10分泌，以抑制小鼠過敏反應，改善臨床癥狀及組織病理學。本研究為AR的治療提供了一種新的選擇，但具體能否應用于臨床仍需臨床試驗驗證。