生防菌鏈霉菌對西瓜枯萎病防治及幼苗生長的影響

孫洪寶, 李茂營, 吳慧玲, 郭紹貴, 張 潔, 任 毅, 張海英, 宮國義, 許 勇

(1.北京農學院植物科學技術學院，北京 102206；2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，國家蔬菜工程技術研究中心，北京 100097；3.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097)

西瓜是世界上重要的園藝作物[1]，中國的西瓜栽培面積、總產量與人均消費量均居世界首位[2]。由于大棚種植長期連作引起連作障礙導致土壤理化性質發生變化，病原菌增加，極易引發病害，特別是枯萎病的大規模爆發已成為制約西瓜生產的重要因素[3]。

西瓜枯萎病是由鐮孢屬尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveurn)寄生引發的真菌土傳病害，嚴重影響西瓜產量和品質[4]。西瓜枯萎病的防治主要有砧木嫁接、培育抗病品種、輪作換茬及藥劑防治等。但各具弊端，如嫁接導致果實風味和品質下降、抗病品種選育周期長、農藥濫用引發環境污染等[5]。與之比較，生物防治有著安全、環保等優點。

鏈霉菌(Streptomyces)廣泛分布于各類土壤中，因其能產生多類具有重要價值的次級代謝產物而倍受關注，在醫藥及農業領域有廣泛的應用[6]。從土壤中分離篩選的利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02，其代謝產物對植物病原真菌具有廣譜抗性[7]，可通過產生納他霉素影響真菌的生長[8]，A02發酵液也可誘發番茄體內防御酶活性，增強抗灰霉病的防御體系[7]。鏈霉菌VSMGT1014乙酸乙酯提取物對植物病原真菌有很好的拮抗作用[9]。鏈霉菌SSD49對蘋果輪紋病病原菌、板栗疫病病原菌和大豆核盤菌等多種植物病原菌具有明顯的抑制作用[10]。鏈霉菌M527發酵液能夠抑制黃瓜枯萎病菌的生長[11]。鏈霉菌可以提高辣椒，黃瓜，草莓等作物多酚氧化酶活性，增強植物整體防御機能，降低病害的發生[12-14]。鏈霉菌還可以對植物生長發育產生一系列的促進作用，從而提高植物的抗病性[15-16]。如一些植物根際鏈霉菌可產生有效促進植物生長的吲哚乙酸[17]。

試驗研究了鏈霉菌A02對西瓜枯萎病的防控效果以及對西瓜生長發育的影響，分析其固態菌劑對西瓜枯萎病防控應用的可行性，為鏈霉菌A02在生產上的推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種：枯萎病感病西瓜品種“YX”，由北京市農林科學院蔬菜研究中心西瓜課題組提供。

供試菌株：利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02由北京市農林科學院植物保護環境保護研究所提供；Fusariumoxysporumf.sp.niveurnrace1(FON1)西瓜枯萎病生理小種1(FON1)，由北京市農林科學院蔬菜研究中心抗病公共平臺保存。

1.2 鏈霉菌A02皿上抑菌測定

將西瓜枯萎病菌菌餅置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板中央，距病菌等距離兩側接種鏈霉菌，以無菌空白PDA餅塊為對照，每個處理重復3次。于25 ℃培養箱培養3～4 d后，觀察鏈霉菌對枯萎病菌拮抗和抑制效果。

1.3 鏈霉菌A02固態菌劑和病原菌孢子懸浮液的制備

鏈霉菌固態菌劑的制備：鏈霉菌A02菌株發酵溫度28 ℃，初始pH為7.0左右，接種量15%，培養6天。黃豆粉、麩皮與沙土占大米重量5%、20%與30%，米水比為1:1.5。發酵完成后干燥粉碎，活菌計數后待用。

FON1孢子懸浮液的制備[18]：將FON1菌塊放在PDA培養基表面，置于28 ℃培養箱中，暗培養 3 d，從菌落邊緣挑取菌餅，接種于PD(馬鈴薯葡萄糖液體培養基)培養基中，繼續在28 ℃條件下搖床振蕩(250 r/min)暗培養7 d，用血球計數板計數，調整孢子濃度為5×106conidia/mL。

1.4 鏈霉菌A02對西瓜枯萎病防控試驗

1.4.1 盆栽試驗設計

試驗在北京市農林科學院蔬菜研究中心空調溫室內展開，高壓滅菌后的營養土裝入育苗穴盤中(54 cm×28 cm)，每穴盤播種催芽露白的西瓜種子100粒，待西瓜真葉初展時，按照每營養缽(9 cm×9 cm)含0.25 g、0.5 g與1.0 g鏈霉菌A02固態菌劑(1×109CFU/g)的量，與滅菌土混勻后分裝于營養缽中，選取長勢較為一致的西瓜幼苗進行病原菌接種，采用浸根接種法[19]，浸根完成后定植到營養缽中。

試驗共分為6個處理，分別為清水對照(Ctrl)、單獨接種鏈霉菌A02固態菌劑(Ctrl+A02)、單獨接種西瓜枯萎病菌(FON1)、接種西瓜枯萎病菌與0.25 g鏈霉菌A02(FON1+0.25 g A02)、接種西瓜枯萎病菌與0.5 g鏈霉菌A02(FON1+0.5 g A02)以及接種西瓜枯萎病菌與1.0 g鏈霉菌A02(FON1+1.0 g A02)。每個處理3個重復，每個重復30株西瓜幼苗，接種處理后遮蔭2～3 d，溫度保持在28 ℃。10 d后進行發病植株病情調查。

1.4.2 試驗測定指標與方法

抗病性指標測定：西瓜苗期枯萎病的鑒定方法參照Martyn等的分級標準[20]，并參照康振生和宗兆鋒[21]的方法計算枯萎病病情指數。

接種處理14 d后，對西瓜幼苗生長指標與生理指標進行測定。

株高：用直尺測定莖基部到頂部之間的距離。莖粗：用游標卡尺測定中部莖粗度。植株鮮重與干重：植株洗凈，用電子天平測定鮮重，65 ℃烘干后，測定干重。

光合作用相關指標測定：采用美國LiCOR公司的LiCOR-6400便攜式光合儀測定，以不同處理西瓜植株完全展開功能葉為材料，測定葉片胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)以及凈光合速率(Pn)。用SPAD-502型葉綠素儀在植株功能葉上測定葉綠素含量(SPAD)。

植物激素測定：稱取西瓜葉片1.0 g，采用高效液相色譜法測定激素含量。

1.4.3 數據統計與分析

數據統計分析利用Excel 2010整理原始數據，同時采用DPS V16.05軟件，差異顯著性分析利用LSD法進行多重比較，試驗數據采用“平均值”表示。

2 結果與分析

2.1 鏈霉菌A02皿上抑菌效果

通過瓊脂塊法拮抗性和發酵液抑菌活性逐級篩選，在候選的100余株鏈霉菌中，得到2株鏈霉菌與西瓜枯萎病FON1形成明顯的拮抗帶，將其中一株鏈霉菌A02與病原菌進行皿內抑制試驗，對峙培養4 d后可觀察到枯萎病菌生長受到了明顯的抑制，菌落形狀為不規則形狀，如圖1所示。這表明鏈霉菌A02對西瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用。

圖1 鏈霉菌A02對FON1皿內抑制效果

2.2 鏈霉菌A02對西瓜枯萎病的防效

如表1所示，與單接種病原菌對照相比接種鏈霉菌A02能顯著降低西瓜枯萎病的發病率和病情指數，不同濃度A02處理的防病效應也存在差異，0.5 g A02固體菌劑處理的效果優于0.25 g和1.0 g A02固體菌劑處理，對枯萎病防治效果也以0.5 g A02固體菌劑效果最好，對枯萎病防效達到68.23%，顯著高于0.25 g A02(57.75%)和1.0 g A02(62.74%)。綜合比較，選取0.5 g A02固體菌劑處理進行后續試驗。

如圖2所示，FON1處理導致西瓜幼苗整株嚴重萎蔫并枯死，而FON1+A02的西瓜幼苗病害程度降低并且新葉無病癥，表明鏈霉菌A02對西瓜枯萎病具有顯著的防控效果。

表1 不同處理對西瓜枯萎病的防治效果

注：數據是四次重復的平均值。當P≤0.05時，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

圖2 鏈霉菌A02對西瓜枯萎病防病效果

2.3 鏈霉菌A02對西瓜幼苗生長的影響

如表2所示，FON1處理西瓜幼苗的株高、莖粗、鮮重及干重較清水對照顯著性降低(P<0.05)，嚴重影響西瓜幼苗生長。FON1+A02處理條件下西瓜幼苗株高、莖粗、鮮重及干重與FON1單獨處理相比分別增加20.4%、25.8%、49.5%和41.3%(P<0.05)，表明鏈霉菌A02能顯著緩解枯萎病菌對西瓜幼苗生長的不利影響。與清水對照相比，添加A02處理西瓜幼苗株高與鮮重分別增加11.1%和4.9%(P<0.05)，表明鏈霉菌A02對西瓜幼苗生長具有一定的促進作用。

表2 枯萎病接種條件下鏈霉菌A02對西瓜生長的影響

注：數據是四次重復的平均值。當P≤0.05時，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

如表3所示，FON1處理條件下光合作用相關指標與清水對照相比均有顯著降低，FON1+A02處理條件下Pn、Ci、Gs、Tr及SPAD值較FON1單獨處理分別增加17.9%、8.1%、75%、31.3%和10.7%(P<0.05)，表明鏈霉菌A02可減輕枯萎病對西瓜幼苗光合系統的影響，增強西瓜葉片光合作用能力，進而增加光合產物的積累；氣孔是植物與外界進行氣體交換的主要通道，與清水對照相比，Ctrl+A02西瓜葉片氣孔導度(Gs)提高27.3%(P<0.05)，蒸騰速率(Tr)提高20.8%(P<0.05)，表明植物生長適應性的增強，鏈霉菌A02對西瓜植株生長具有一定的促進作用。

表3 枯萎病接種條件下鏈霉菌A02對西瓜光合作用相關指標的影響

注：數據是四次重復的平均值。當P≤0.05時，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

如表4所示，FON1單獨處理條件下西瓜幼苗體內IAA含量低于可測水平，施用鏈霉菌A02后，FON1+A02處理中西瓜幼苗體內IAA含量顯著性增加，SA較FON1單獨處理增加62.00%(P<0.05)。

表4 枯萎病接種條件下鏈霉菌A02對西瓜激素含量的影響

注：數據是四次重復的平均值。當P≤0.05時，同一列中后跟相同字母的值沒有顯著性差異。

3 討論與結論

利用生防鏈霉菌防治西瓜枯萎病國內外已有報道。任遷琪等[22]從辣椒根際土中篩選出10株對西瓜枯萎病有拮抗作用的放線菌，其中菌株F32為鏈霉菌屬，對西瓜枯萎病的防效可達66.7%。但鑒于土傳病害易受植物根際環境因素的影響，針對西瓜枯萎病使用單一生防菌劑的防效不高，且穩定性差，生產上亟需提供高效的防病促生的鏈霉菌生防制劑。固體發酵具有設備簡單、成本低等優點，具有良好的發展前景，在本研究中，采用鏈霉菌A02固態發酵菌劑，盆栽試驗表明A02對西瓜枯萎病防效高達68.23%，病情指數由79.39降至25.22，表明鏈霉菌A02固態發酵菌劑可有效防治西瓜枯萎病。目前研究大多數以盆栽試驗等控制條件為主，尚需在大田等復雜環境中驗證鏈霉菌的生防效果。

鏈霉菌不僅能通過誘導植物系統抗性實現其生防作用，還可通過影響植物光合作用能力和內源激素含量等生長發育指標來影響其植物抗病性[23]，Wu等[24]發現利迪鏈霉菌(S.lydicus)能夠增加番茄(Lycopersiconesculentum)葉片數量，提高光合能力，促進生長，并且增加植株體內水楊酸與脫落酸等植物生長調節劑含量，魏曉麗等[25]發現鏈霉菌對黃萎病接種條件下仍然具有促進棉花生長和提高光合生理特性的作用。辣椒內生細菌 BS-2可提高辣椒和白菜的生長類激素含量，減少脫落酸含量[26]，植物體內生菌株XG32具ACC脫氨酶的活性，可以分泌IAA，促進植物的生長[27]。鏈霉菌JD211處理水稻幼苗后，促進生長提高株高與鮮重，并對水稻稻瘟病有極顯著的抑制作用[28]。本研究中施用鏈霉菌A02后，西瓜幼苗株高與鮮重較對照增加11.1%和4.9%，西瓜幼苗葉片的葉綠素含量較對照組增加8.46%。鏈霉菌A02與枯萎病菌同時接種，西瓜幼苗葉片凈光合速率(Pn)、細胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)以及蒸騰速率(Tr)均有顯著性增加。在接種西瓜枯萎病條件下施用鏈霉菌A02后，西瓜幼苗葉片IAA含量顯著增加，SA較FON1單獨處理增加62.00%(P<0.05)。

綜上研究結果表明，鏈霉菌A02對西瓜枯萎病具有良好的防控效果，進一步明確鏈霉菌A02固態菌劑作為生防農藥的良好的應用前景。也可以考慮將其應用于其他作物病害的生物防治研究中。