通過敲除解淀粉芽胞桿菌表面活性劑基因促進S-腺苷甲硫氨酸合成

姜聰，郭愛玲，魏雪團

(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)，是生物體內含硫氨基酸代謝的一個關鍵組成部分，由甲硫氨酸和三磷酸腺苷通過蛋氨酸腺苷轉移酶合成[1]。SAM在細胞中主要參與轉甲基化[2]、轉硫化[3]和脂肪多胺合成[4]，被視為生物體中的關鍵代謝物，常用于預防和改善肝病、關節炎、抑郁癥、阿爾茨海默氏癥等多種疾病[5-7]。歐美國家已將其批準用作膳食補充劑[8]。因此，開發SAM相關產品具有重要的意義。

微生物發酵法是生產SAM的主要方法。早期的研究普遍通過添加大量甲硫氨酸前體物來實現SAM的高效合成，產量可達10 g/L以上[9]，但甲硫氨酸添加量大、成本高，且轉化率低，導致SAM價格昂貴[10]。進而有研究者以廉價糖類碳源從頭合成SAM，以期降低發酵成本[11]。然而，目前從頭合成SAM的產量仍較低，尚需開展深入研究。課題組前期通過解淀粉芽胞桿菌從頭合成SAM，通過途徑耦合代謝工程策略強化了SAM的合成[12]，該法在SAM的從頭合成中具有重要的應用潛力，但仍需開展大量研究工作。

解淀粉芽胞桿菌可大量合成兩親性脂肽類表面活性劑副產物[13]，不僅消耗大量的能量，而且這些表面活性劑可導致發酵過程起泡嚴重，影響發酵過程[14]。芽胞桿菌產生的脂肽類表面活性劑主要包括iturin和surfactin，其中iturin主要由ituDABC操縱子基因編碼[15-16]，surfactin主要由srfA-ABCD操縱子基因編碼[17-18]。通過基因敲除技術阻斷iturin和surfactin的合成有望促進SAM的合成，然而目前還未見相關報道。因此，本研究通過基因敲除技術敲除解淀粉芽孢桿菌中的ituD和SrfAC基因，阻斷iturin和surfactin的合成，以期降低發酵過程脂肽類副產物和發酵泡沫，以期提高SAM產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

本研究所用到的菌株和質粒如表1和表2所示。其中大腸桿菌DH5α用于構建載體。

表1 實驗用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 實驗用質粒Table 2 Plasmids used in this study

注：Tetr：四環素抗性；Kanr：卡那霉素抗性；orits：溫敏型復制子

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物見表3。

表3 本研究所使用的PCR引物Table 3 Primers used for PCR in this study

注：粗體為限制性內切酶酶切位點，劃線為重疊延伸PCR (SOE-PCR)的重疊區域

1.1.3 主要培養基

SAM發酵培養基(g/L):蔗糖80，蛋白胨10，玉米漿5，天冬氨酸3，尿素2，NaCl 2.5，(NH4)2SO46.3，KH2PO43，MgSO4·7H2O 4.2，pH 6.5。

LB培養基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.2，固體培養基加瓊脂1.5%。

1.1.4 工具酶和試劑

DNA抽提試劑盒,武漢楚誠正茂科技工程有限公司；TransStartR FastPfuDNA聚合酶和TransStartR easyTaqDNA聚合酶,北京全式金公司；DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶，DNA回收試劑盒和質粒抽提試劑盒，美國OmegaBio-Tek公司；DL5000 Marker，TaKaRa公司；瓊脂糖，Spanish公司；Kan、Tet、溶菌酶、山梨醇、甘露醇等試劑等均為進口分裝，武漢楚誠正茂科技工程有限公司，biosharp；甲醇為色譜級，其他主要生化試劑均為國產分析級純或進口分裝。

1.1.5 儀器與設備

Agilent Technologies 1260高效液相色譜，美國Agilent公司；Thermal Cycler (My Cycler) PCR儀，美國 Bio-Rad 公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；CR21G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；HQL300B恒溫大幅振蕩搖床，武漢中科科儀技術發展有限責任公司；SKP-02.420電熱恒溫培養箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 敲除載體的構建

以ituD基因為例，選取B.amyloliquefaciensHZ-12的基因組DNA作為模板，利用上游同源臂引物(ΔituD-AF, ΔituD-AR)和下游同源臂引物(ΔituD-BF，ΔituD-BR)分別擴增出同源臂序列A和B，產物純化回收后通過SOE-PCR用引物ΔituD-AF、ΔituD-BR將A和B連接起來，并與T2(2)-ori載體同時用限制性內切酶SpeI和XbaI進行雙酶切，回收后用T4DNA連接酶連接，采用CaCl2轉化法轉化到E.coliDH5α感受態細胞。鈣轉化成功后提取質粒進行雙酶切驗證并送往測序公司測序，構建成功的敲除質粒命名為T2(2)-oriΔituD。

1.2.2 基因敲除菌株的構建[12]

以ituD基因為例，將構建成功的質粒電轉化入HSAM4感受態細胞中，涂布至含Kan的抗性平板，37 ℃靜置培養16～18 h。挑選轉化子單菌落于Kan平板上劃線，培養8～12 h后進行PCR菌落驗證(引物T2-F,T2-R)。將電轉正確的菌株在45 ℃下進行單交換，ΔituD-YF/YR引物和T2引物驗證；獲得的單交換菌株在37 ℃下進行雙交換，挑選在LB板上長而在Kan抗性板上不長的單菌落，用ΔituD-YF和ΔituD-YR驗證，篩選到敲除菌株，命名為HSAM4ΔituD。

1.2.3 發酵培養條件

從超低溫冰箱中取出保藏的菌種劃線LB平板培養基中，37 ℃培養基12 h。挑取適量菌體于裝有50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃，180 r/min培養9 h。吸取體積分數1.5%的菌液接種于裝有25 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min發酵培養，每個菌設置3個搖瓶重復。

1.2.4 SAM液相檢測[12]

取發酵液0.5 mL，加1.5 mL 0.4 mol/L高氯酸，提取1 h(每15 min振蕩1次)，10 000 r/min離心5 min。取800 μL上清液，加100 μL，2 mol/L NaOH調pH。利用HPLC檢測，色譜柱為XDB-C18(規格：5 μm，4.6 mm×150 mm)，檢測器為紫外檢測器，流動相為V(甲醇)∶V(40 mmol/L NH4H2PO42 mmol/L庚烷磺酸鈉)=18∶82，流速為0.8 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm。

1.2.5 數據統計分析

每組實驗設計3個重復，采用SPSS 20.0進行數據統計分析，評估數據差異的顯著性，計算出平均值和標準偏差，采用Origin 8.5進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 ituD基因缺失對解淀粉芽孢桿菌合成SAM的影響

2.1.1ituD基因缺失菌株的構建

利用1.2.1小節中所述的方法構建重組載體T2(2)-oriΔituD，利用表3中相應的引物ΔituD-AF/AR，ΔituD-BF/BR擴增用于構建T2(2)-oriΔituD的上下游同源臂。敲除ituD基因的上下游同源臂大小分別為513和504 bp，上下游同源臂經SOE-PCR融合后的產物大小為1 017 bp，上下游同源臂SOE-PCR融合片段與T2(2)-ori質粒經酶切和酶連后轉化至E.coliDH5α，選取驗證正確的陽性轉化子，提取質粒并且測序結果正確無誤，表明敲除質粒T2(2)-oriΔituD構建成功。

將已構建完成的重組質粒T2(2)-oriΔituD電轉化至HASM4中，篩選出陽性轉化子，并按照1.2.2的方法進行單交換和雙交換篩選突變株。經菌落PCR驗證正確的雙交換菌株，提取基因組DNA，并利用表3中相應的引物ΔituD-YF/YR驗證原始菌株HSAM4和陽性交換突變株，片段大小分別為2 508、1 290 bp，兩片段相差的長度正好是ituD基因的長度，PCR驗證電泳圖如圖1所示。且純化回收陽性交換突變株PCR產物，經測序確認堿基正確無誤，說明缺失ituD基因的菌株HSAM4ΔituD構建成功。

1-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗證HSAM4(2 508 bp);2-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗證HSAM4ΔituD(1 290 bp)圖1 HSAM4ΔituD菌株的PCR驗證電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔituD

2.1.2ituD基因缺失對SAM合成的影響

為了考察ituD基因的缺失對B.amyloliquefaciensHSAM4合成SAM的影響，按照1.1.3和1.2.3小節的發酵培養基和培養條件對工程菌株HSAM4ΔituD進行發酵驗證，發酵周期為60 h。發酵結束后取樣檢測SAM產量和菌體生物量(OD600)，結果如圖2所示。

圖2 缺失ituD基因對SAM合成的影響Fig.2 Effect of ituD knockout on SAM fermentation

由圖2可以看出，原始菌 HSAM4與HSAM4ΔituD的生物量無顯著差異，說明ituD基因缺失對菌體生長無影響。此外，缺失菌株HSAM4ΔituD的SAM產量與原始菌 HSAM4相比，沒有顯著性提高。上述結果說明敲除ituD基因對菌體生長和產物的合成未產生顯著性影響。

2.2 srfAC基因缺失對解淀粉芽孢桿菌合成SAM的影響

2.2.1srfAC基因缺失菌株的構建

敲除質粒T2(2)-oriΔsrfAC來自本實驗室保存。將T2(2)-oriΔsrfAC電轉化至HASM4中，篩選出陽性轉化子，并按照1.2.2的方法進行單交換和雙交換篩選突變株。經菌落PCR驗證正確的雙交換菌株，提取基因組DNA，并利用表3中相應的引物ΔsrfAC-YF/YR驗證原始菌株HSAM4和陽性交換突變株，片段大小分別為 2 704和1 657 bp，兩片段相差的長度正好是srfAC基因的長度，PCR驗證電泳圖如圖3所示。純化回收陽性交換突變株PCR產物，經測序確認堿基正確無誤，說明缺失srfAC基因的菌株HSAM4ΔsrfAC構建成功。

1-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗證HSAM4(2 704 bp);2-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗證HSAM4ΔsrfAC(1 657 bp)圖3 HSAM4ΔsrfAC菌株的PCR驗證電泳圖Fig.3 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔsrfAC

2.2.2srfAC基因缺失對SAM合成的影響

為了考察srfAC基因的缺失對B.amyloliquefaciensHSAM4合成SAM的影響，按照1.1.3和1.2.3小節的發酵培養基和培養條件對工程菌株HSAM4ΔsrfAC進行發酵驗證，發酵周期為60 h。發酵結束后取樣檢測SAM產量和菌體生物量(OD600)，結果如圖4所示。

圖4 缺失srfAC基因對SAM合成的影響Fig.4 Effect of srfAC knockout on SAM fermentation

由圖4可以看出，工程菌 HSAM4ΔsrfAC的生物量相比于原始菌沒有發生顯著性變化。缺失菌株 HSAM4ΔsrfAC的SAM 產量為 208.24 mg/L，比原始菌HSAM4提高了23%，差異顯著。推測其原因，srfAC基因編碼surfactin合成酶[17]，影響脂肽的環化與釋放，減少了表面活性劑surfactin的合成，可降低副產物和發酵產泡現象，從而促進SAM的合成。

2.3 ituD基因和srfAC基因雙缺失對解淀粉芽孢桿菌合成SAM的影響

2.3.1ituD基因和srfAC基因雙缺失菌株的構建

將T2(2)-oriΔsrfAC電轉化至HASM4ΔituD中，篩選出陽性轉化子，并按照1.2.2的方法進行單交換和雙交換篩選突變株。經菌落PCR驗證正確的雙交換菌株，提取基因組DNA，并利用表3中相應的引物ΔituD-YF/YR和ΔsrfAC-YF/YR驗證原始菌株HSAM4和陽性交換突變株，與原始菌相比分別相差ituD基因和srfAC基因的長度，PCR驗證電泳圖如圖5所示。純化回收陽性交換突變株PCR產物，經測序確認堿基正確無誤，說明缺失ituD和srfAC基因的菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC構建成功。

1-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗證HSAM4(2 508 bp);2-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR驗證HSAM4ΔituDΔsrfAC(1 290 bp);3-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗證HSAM4(2 704 bp);4-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR驗證HSAM4ΔituDΔsrfAC(1 657 bp)圖5 HSAM4ΔituDΔsrfAC菌株的PCR驗證電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔituDΔsrfAC

2.3.2ituD基因和srfAC基因雙缺失對SAM合成的影響

按照1.1.3和1.2.3小節的發酵培養基和培養條件對工程菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC進行發酵驗證，發酵周期為60 h。發酵結束后取樣檢測 SAM 產量和菌體生物量(OD600)，結果如圖6所示。

圖6 缺失ituD,srfAC基因對SAM合成的影響Fig.6 Effect of ituD,srfAC knockout on SAMfermentation

由圖6可以看出，工程菌HSAM4ΔituDΔsrfAC的生物量相比于原始菌 HSAM4無明顯變化，說明ituD和srfAC基因雙缺失對菌體的生長無影響。缺失菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC的SAM的產量達222.95 mg/L，相比于原始菌 HSAM4提高了32%。這可能是敲除ituD基因和srfAC基因，同時阻斷了iturin和surfactin的合成[15,17]，降低發酵副產物和發酵產泡現象，進一步提高了SAM產量。

3 結論

S-腺苷甲硫氨酸是存在于生物體中的必需功能因子[19]。在不添加甲硫氨酸的前提下，通過廉價碳源實現SAM的高效從頭合成具有重要的意義。解淀粉芽胞桿菌在從頭合成SAM的過程中顯示了初步的效果[12]，為有效提高SAM的從頭合成產量，本文基于基因敲除技術，成功構建了ituD基因缺失菌株HSAM4ΔituD，srfAC基因缺失菌株HSAM4ΔsrfAC，ituD、srfAC基因雙缺失菌株 HSAM4ΔituDΔsrfAC。SAM發酵結果顯示，缺失ituD、srfAC基因對菌株生長幾乎無影響，雙缺失菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC的SAM產量可提高至原始菌株HSAM4的1.32倍。

ZHANG等[20]研究發現，利用BacillussubtilisATCC 6051a發酵生產環糊精糖基轉移酶過程中，敲除該菌株的srfAC基因可有效控制發酵過程中的泡沫。Iturin和surfactin作為兩親性脂肽類表面活性物質，是液體深層發酵產泡的重要原因。由此推測，本研究ituD和srfAC基因的缺失，阻斷了iturin和surfactin的產生，不僅可減少發酵過程中副產物的生成及不必要的能量消耗，而且可通過降低表面活性劑改善發酵產泡現象，這可能是SAM產量提高的主要原因。本研究為SAM從頭合成的代謝工程育種提供了新的思路和方向。