基于代謝工程構建產β-胡蘿卜素重組畢赤酵母

劉潔，王宏濤，錢和，徐建中*，張偉國*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

β-胡蘿卜素(β-carotene)具有多種關鍵的生物學功能[1]，被廣泛應用于食品添加劑、保健品和飼料添加劑[2]。近年來，有研究報道β-胡蘿卜素具有預防癌癥、心血管疾病和抗衰老的功效[3]，因此其市場需求急劇增加。然而，提取法和化學合成法生產β-胡蘿卜素存在產量低及食品安全等問題[4-5]。近年來，隨著代謝工程的快速發展和人們對異源表達系統的深入研究，構建工程菌株異源合成β-胡蘿卜素成為熱點[6-7]。目前，用于異源生產β-胡蘿卜素的模式菌株主要是大腸桿菌和釀酒酵母，但由于存在缺少蛋白修飾、培養條件較復雜及發酵規模不易擴大等問題而不易實現工業化[8-9]。畢赤酵母表達系統成本低、周期短、表達量高且可高密度培養，為大規模生產β-胡蘿卜素帶來了希望[10-12]。ARAYA-GARAY等[12]首次構建了異源表達歐文氏菌類胡蘿卜素相關基因的巴斯德畢赤酵母突變菌株，所得菌株的β-胡蘿卜素產量僅為339 μg/g(DCW)。我們預測，引入鎖擲酵母類胡蘿卜素途徑可以獲得更高β-胡蘿卜素產量的重組巴斯德畢赤酵母。

本研究首次克隆來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素基因并在巴斯德畢赤酵母中異源表達以產生β-胡蘿卜素，并探索單個或多個類胡蘿卜素基因對β-胡蘿卜素生產的影響。這項研究為基于代謝工程異源合成β-胡蘿卜素提供了新的案例并有望推進β-胡蘿卜素工業化生產的進程。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

鎖擲酵母(Sporidioboluspararoseus) JD2保藏于中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)，記錄號為CCTCC M2010326；大腸桿菌DH5α、野生型巴斯德畢赤酵母X-33和大腸桿菌-酵母穿梭質粒pGAPZA、pPIC9k購自Invitrogen。

1.2 試劑與儀器

限制性內切酶，Thermo Scientific；TaqDNA聚合酶、DNA Mark、MutExpress?快速誘變試劑盒、DNA切膠回收試劑盒、cDNA合成試劑盒,Vazyme；T4DNA連接酶、酵母RNA提取試劑盒,TaKaRa；PCR引物、質粒快速提取試劑盒,上海生工；酵母基因組提取試劑盒,康為世紀；qPCR染料試劑盒,BBI；博來霉素、卡那霉素,Invitrogen；標準品β-胡蘿卜素、玻璃珠,Sigma；色譜純二氯甲烷、乙腈,國藥沃凱；其他試劑均為國藥分析純。

臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；真空冷凍干燥機，日本Toshiba公司；高效液相色譜儀，德國Agilent公司；電脈沖基因轉移儀，美國BIO-RAD公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.3 培養基

LLB培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5.0，NaCl 5.0；YPD培養基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10；BMGY培養基(g/L)：蛋白胨20，酵母膏10，甘油10，YNB 13.4，生物素0.5，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 (pH 6.0)。

1.4 β-胡蘿卜素表達載體的構建

提取鎖擲酵母總RNA并進行瓊脂糖凝膠電泳驗證其完整性。合成第1條鏈cDNA，設計寡核苷酸引物(表1)。通過PCR獲得含有相應限制位點的crtE、crtYB和crtI基因片段，并通過測序驗證。

表1 本實驗用于PCR的引物Table 1 Primers used in this experiment for PCR

質粒pGAPZA的定點誘變按照制造商的說明進行，以產生不含有AvrⅡ位點的載體pGAPZA*并通過DNA測序驗證。將基因片段與載體連接以分別產生質粒pGAPZA-E，pGAPZA*-I和pGAPZA*-YB，將來自pGAPZA*-I和pGAPZA*-YB的表達盒無縫克隆到pGAPZA-E的BamHⅠ位點以產生質粒pGAPZA-EYBI(圖1)。

圖1 質粒pGAPZA-EYBI構建過程Fig.1 Construction of plasmid pGAPZA-EYBI

1.5 巴斯德畢赤酵母的轉化和篩選

用AvrⅡ將pGAPZA-EYBI線性化，按照ARAYA-GARAY等[12]的方法進行巴斯德畢赤酵母感受態細胞的制備和電穿孔。電擊后，立即加入1 mL預冷的無菌山梨糖醇，混合物30 ℃靜置1 h，涂布在含有100 μg/mL博來霉素的YPD板上。將平板置于30 ℃培養箱中2～4 d以篩選重組菌落。使用快速酵母基因組DNA分離試劑盒提取巴斯德畢赤酵母基因組DNA，并通過PCR驗證基因整合到基因組中。

1.6 細胞質量濃度測定

發酵液經過適當的稀釋后，以清水作為對照,測定OD600值。取1 mL發酵液于10 000 r/min下離心，棄上清液，用清水洗滌2次后于烘箱中90 ℃烘干至恒重，得到菌體干重。

1.7 β-胡蘿卜素含量的測定

在參考文獻[13]的基礎上稍作改動，進行β-胡蘿卜素提取。培養72 h后，離心菌體用雙蒸水洗滌2次，收集細胞進行冷凍干燥。將細胞干粉溶于1 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)并加入玻璃珠渦旋1 min，55 ℃提取30 min，重復提取直至細胞無色。萃取液在氮氣流下干燥，然后溶解在丙酮中進行HPLC分析。在配備有ZORBAX SB-C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm) 的Agilent Technologies 1 260 Infinity HPLC系統上于30 ℃進行β-胡蘿卜素分離和定量。流動相由溶劑A(乙腈) 和溶劑B(二氯甲烷)組成[14]，梯度程序如下：A在10 min內從100%到50%線性梯度洗脫5 min；然后回到100%。流速為1 mL/min，檢測波長為450 nm，通過比較樣品和β-胡蘿卜素標準品的峰面積進行定量分析。

1.8 β-胡蘿卜素合成途徑中crt基因的qPCR分析

菌株在YPD培養基中搖瓶培養至對數生長期，使用酵母RNA提取試劑盒提取重組畢赤酵母總RNA并合成cDNA第1條鏈。將引物(表2)和熒光染料添加到cDNA中進行qPCR。

表2 本實驗用于qPCR的引物Table 2 Primers used in this experiment for qPCR

為了校正起始量的差異，將核糖體18S RNA作為管家基因。通過溶解曲線確認PCR產物的特異性，并且通過2-ΔΔCt方法進行相對基因表達分析[15]。

1.9 重組畢赤酵母搖瓶發酵條件優化

為了進一步提高重組畢赤酵母中β-胡蘿卜素的產量，對影響酵母生長和表達的重要因素進行優化。將重組菌接種于10 mL YPD培養基中，于30 ℃、200 r/min下過夜培養作為種子液。以5%的接種量接種于含有50 mL BMGY培養基的500 mL搖瓶中進行發酵培養。選取合適的梯度范圍進行單因素優化[16-19]，每組試驗設置3個平行，分別測定β-胡蘿卜素產量。

2 結果與分析

2.1 鎖擲酵母類胡蘿卜素基因的克隆與序列分析

常用于異源合成β-胡蘿卜素的類胡蘿卜素基因主要來自歐文氏菌(Erwiniauredovora)和紅發夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)[12]。據報道，鎖擲酵母合成類胡蘿卜素的能力更強，這表明其類胡蘿卜素基因可能更適合于β-胡蘿卜素的合成[20]。通過逆轉錄從鎖擲酵母中獲得crtE(KY652916.1)、crtYB(KR108013.1)和crtI(KR108014.1)(圖2)。為了了解鎖擲酵母類胡蘿卜素基因，進行氨基酸多序列比對,如圖3所示。

1-crtI；2-crtYB；3-crtE圖2 鎖擲酵母類胡蘿卜素基因擴增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of target gene amplification andrecombinant plasmid verification

來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素基因與來自X.dendrorhous和E.uredovora的類胡蘿卜素基因具有較高的同源性，推測其活性位點一致。另外，鎖擲酵母高效的類胡蘿卜素合成途徑顯示出其編碼酶基因可能具有更高的催化活性。

2.2 巴斯德畢赤酵母中β-胡蘿卜素生物合成途徑的構建

巴斯德畢赤酵母中不存在天然質粒，外源基因需要整合在基因組中進行表達[12]。因此，本研究構建了穩定表達質粒pGAPZA-EYBI，將其整合到巴斯德畢赤酵母基因組中以獲得重組菌株Pp-EYBI。Pp-EYBI在BMGY培養基搖瓶培養72 h，用于色素提取。

a- crtE氨基酸序列比對;b- crtYB氨基酸序列比對;c- crtI氨基酸序列比對圖3 不同來源的類胡蘿卜素基因氨基酸多序列比對Fig.3 Amino acid multiple sequence alignment of carotenoid genes from different sources

如圖4所示，HPLC分析表明，重組畢赤酵母Pp-EYBI中β-胡蘿卜素的產量為818 μg/gDCW，是ARAYA-GARAY等[12]先前報道的2.4倍。這些結果證實，由于宿主偏好和相關酶的催化活性，來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素基因在巴斯德畢赤酵母中表現更好。

2.3 重組畢赤酵母β-胡蘿卜素合成限速酶基因的確定

編碼限速酶基因的過表達是代謝工程提高產量的重要策略之一[21]。為確定重組巴斯德畢赤酵母中β-胡蘿卜素合成的限速步驟，構建了重組菌株Pp-EYBI+I和Pp-EYBI+YB。搖瓶培養72 h后，HPLC結果顯示，菌株Pp-EYBI+YB中β-胡蘿卜素產量增至1 576 μg/gDCW，而Pp-EYBI+I菌株中β-胡蘿卜素積累量下降了16%。

a- β-胡蘿卜素標準品;b- 重組菌株Pp-EYBI中提取的色素圖4 β-胡蘿卜素HPLC色譜圖Fig.4 β-carotene HPLC chromatogram

為了確定類胡蘿卜素基因是否正確表達并進一步了解產生不同β-胡蘿卜素的原因，分別在Pp-EYBI、Pp-EYBI+I和Pp-EYBI+YB菌株中研究了crt基因的轉錄水平(圖5)。在野生型細胞中，無法檢測到crtE、crtYB和crtI的表達(數據未顯示)。與Pp-EYBI相比，Pp-EYBI+I菌株中crtE和crtI基因的轉錄水平顯著增加，而crtYB基因幾乎不變。相反，Pp-EYBI+YB菌株中crtYB基因的表達水平比Pp-EYBI細胞高2.44倍。這些結果表明，crtYB是菌株Pp-EYBI合成β-胡蘿卜素的限速酶編碼基因。

圖5 不同重組菌株中β-胡蘿卜素合成相關基因的轉錄水平Fig.5 Transcription levels of β-carotene synthesis-related genes in different recombinant strains

2.4 β-胡蘿卜素合成限速酶基因拷貝數的優化

為進一步提高重組巴斯德畢赤酵母中β-胡蘿卜素的產量，連續引入限速酶基因crtYB。SacⅠ/EcoR Ⅰ雙酶切將AOX1啟動子和α因子替換為GAP啟動子，構建了基于pPIC9k攜帶crtYB的質粒pPIC9k-YB并電轉到Pp-EYBI+YB的感受態細胞中，因其所帶抗性為卡那霉素而不是博來霉素，從而保證篩選順利進行。隨后的研究表明，菌株Pp-EYBI+(YB)2中crtYB表達水平是Pp-EYBI的3.32倍，β-胡蘿卜素的產量達到2.5 mg/gDCW，比Pp-EYBI菌株的產量高310%。結果表明，Pp-EYBI+YB菌株中crtYB拷貝數的增加提高了其表達量表達，從而提高了流向β-胡蘿卜素的通量。為了研究crtYB是否仍然是Pp-EYBI+(YB)2中的限速步驟，構建菌株Pp-EYBI+(YB)3。盡管crtYB的表達水平高達Pp-EYBI的4.53倍，Pp-EYBI+(YB)3中β-胡蘿卜素的產量略有下降，但純度較高(圖6)。推測原因可能是合成β-胡蘿卜素前體物質供應不足所致。

圖6 不同重組菌株合成β-胡蘿卜素的能力Fig.6 The ability of different recombinant strains tosynthesize β-carotene

2.5 β-胡蘿卜素合成前體物質供應的增強

HMG1基因是MVA途徑的限速酶基因，截短的HMG1(tHMG1)基因可以有效解除麥角固醇的反饋抑制提高MVA路徑的通量[22]。為提高工程菌Pp-EYBI+(YB)3中β-胡蘿卜素合成的前體物質供應，克隆來自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C的tHMG1基因(圖7)。構建質粒pGAPZA-H電轉到Pp-EYBI+(YB)3感受態細胞中，篩選獲得重組菌株Pp-EYBI+(YB)3H。結果顯示，Pp-EYBI+(YB)3H中β-胡蘿卜素產量為3.7 mg/gDCW，是Pp-EYBI+(YB)2的1.48倍。

M-marker;1-tHMG1圖7 目的基因tHMG1擴增電泳圖Fig.7 Electrophoresis of target gene tHMG1 amplification

2.6 單因素試驗結果

為進一步提高β-胡蘿卜素產量，對重組菌株Pp-EYBI+(YB)3H搖瓶發酵條件進行單因素優化。優化條件為：甘油添加的體積分數為2%，最適pH 6.0；接種量10%，裝液量50 mL；轉速200 r/min；溫度28 ℃。

3 結論

本研究將來自鎖擲酵母的類胡蘿卜素合成途徑引入巴斯德畢赤酵母中以獲得產β-胡蘿卜素的重組菌株。這是首次報道克隆鎖擲酵母來源的類胡蘿卜素基因并用于異源生產β-胡蘿卜素。本研究對β-胡蘿卜素合成限速酶基因crtYB拷貝數進行優化并過表達MVA途徑限速酶基因tHMG1以提高類胡蘿卜素合成前體物質的供應，最終成功構建一株重組畢赤酵母Pp-EYBI+(YB)3H，其β-胡蘿卜素產量達到3.7 mg/gDCW，是ARAYA-GARAY等[12]報道的10.9倍。本研究構建的巴斯德畢赤酵母工程菌培養基組分成本低廉，成分簡單，方便后期分離純化，為大規模發酵生產β-胡蘿卜素提供了新的策略。