雙歧桿菌生物膜形成規(guī)律及其表面性質(zhì)相關(guān)性研究

朱如意，杭鋒，張灝,，李元昆，趙建新，陳衛(wèi)，陸文偉,*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)(揚(yáng)州)食品生物技術(shù)研究所，江蘇 揚(yáng)州，225004) 3(新加坡國立大學(xué) 楊璐齡醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系，新加坡，119077)

雙歧桿菌是人體和動(dòng)物腸道內(nèi)的固有菌群，在維護(hù)腸道微生態(tài)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)宿主生理功能方面具有重要的作用[1]，被制成菌粉廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品等領(lǐng)域。雙歧桿菌因其特殊的生理特性，在菌粉干燥制備過程中極易死亡。目前主要通過干燥保護(hù)劑配方的優(yōu)化[2]、干燥工藝條件的改良[3]和微膠囊化技術(shù)[4]來提高其存活率，但這些方法治標(biāo)不治本，提高雙歧桿菌自身抗逆性可能是提高生存率的有效選擇。生物膜的形成是微生物適應(yīng)環(huán)境的重要機(jī)制，可顯著提高細(xì)菌的抗逆性。研究發(fā)現(xiàn)，高密度生物膜樣鼠李糖乳桿菌微膠囊比浮游狀態(tài)抗冷凍干燥和耐熱性分別提高了40和12～8 000倍[5]。雙歧桿菌具有生物膜形成能力[6]，且形成生物膜的雙歧桿菌比浮游細(xì)菌具有更好的抗逆性[7]。

生物膜的形成主要分為粘附階段、生長階段、成熟階段和擴(kuò)散階段[8]。初始粘附階段是生物膜形成的關(guān)鍵步驟，它代表著從浮游生物到生物膜模式的轉(zhuǎn)折[9]。初始粘附受多種因素影響，細(xì)菌和載體表面的性質(zhì)如親疏水性[10]、電荷性[11]等，環(huán)境因素[12]如溫度、pH都會(huì)影響細(xì)菌的粘附。根據(jù)擴(kuò)展的Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek理論，影響微生物粘附的主要非共價(jià)相互作用是范德華力、靜電力、路易斯酸堿和布朗運(yùn)動(dòng)力。細(xì)菌細(xì)胞的疏水性代表細(xì)胞間的吸引力，而親水性則反映細(xì)菌細(xì)胞間的斥力[13]。因此，在理論上，隨著細(xì)菌表面疏水性的增加，附著在材料表面的細(xì)菌數(shù)量也隨之增加。細(xì)菌表面的疏水性和路易斯酸堿特性在細(xì)菌與非生物表面的粘附中起著重要作用，因此可用于解釋細(xì)菌與材料表面的附著[14]。但也有研究認(rèn)為，菌株表面的物理和化學(xué)特征不能完全解釋細(xì)菌的粘附性[15]，且這些性質(zhì)如何影響細(xì)菌與材料表面之間的粘附尚不清楚[16]。

本文研究了雙歧桿菌的生物膜形成能力、生物膜結(jié)構(gòu)和活性的差異性，并且探究了雙歧桿菌的表面疏水性和路易斯酸堿特性與生物膜形成能力之間的相關(guān)性，為了解雙歧桿菌的生物膜形成提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

所有雙歧桿菌和變形鏈球菌(Streptococcusmutans)ATCC 25175均由江南大學(xué)食品微生物培養(yǎng)中心提供。

牛肉膏、胰蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、K2HPO4、無水乙酸鈉、MnSO4·H2O、檸檬酸氫二銨、L-半胱氨酸鹽酸鹽、吐溫-80、NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4、二甲苯、氯仿、乙酸乙酯，購自國藥集團(tuán)。FilmTracer LIVE/DEAD生物膜檢測(cè)試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1109C超凈工作臺(tái)，上海智誠分析儀器制造有限公司；DG250厭氧工作站，Whitley公司；Multiscan GO全波長酶標(biāo)儀，Thermo公司；ST40R冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；SU8100冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)公司；LSM710激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雙歧桿菌生物膜形成能力測(cè)定

根據(jù)STEPANOVIC等[17]的方法進(jìn)行改進(jìn)，具體方法如下：將活化3代的雙歧桿菌按2%接種量混合于MRS培養(yǎng)基中，每孔200 μL加入96孔板中，于37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)24 h。用PBS緩沖液洗滌3次，以洗去浮游菌。自然干燥后加入200 μL的0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色30 min，用PBS緩沖液洗滌3次后每孔加入200 μL的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，在酶標(biāo)儀波長600 nm處測(cè)定吸光值。以相同條件下S.mutans成膜能力為陽性對(duì)照組，MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。成膜能力用-、+、++表示(-為OD600 nm≤1，表示雙歧桿菌不成膜；+為1

1.3.2 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)測(cè)定雙歧桿菌生物膜結(jié)構(gòu)

在6孔板中放入無菌蓋玻片，加入新鮮MRS培養(yǎng)基5 mL，并按照1%的接種量接種雙歧桿菌，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片，用無菌水清洗3次，洗去表面浮游菌，用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液在4 ℃下避光固定16 h，用無菌水清洗并依次用體積分?jǐn)?shù)15%、30%、50%、70%、100%乙醇梯度脫水，噴鍍金粉，放入SEM中觀察，加速電壓5 kV，放大倍數(shù)3 000倍[6]。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)測(cè)定雙歧桿菌生物膜

雙歧桿菌生物膜形成方法同1.3.2。用無菌水清洗形成生物膜的蓋玻片后立即避光染色，將3 μL的SYTO 9染料和3 μL碘化丙啶染料加入1 mL無菌水中來制備工作溶液。每個(gè)長有生物膜的玻片加入200 μL染液，避光孵育30 min，用無菌水清洗3次，洗去多余染料。用CLSM進(jìn)行觀察，目鏡倍數(shù)為10倍，物鏡倍數(shù)為20倍，激發(fā)光的波長設(shè)為480 nm/500 nm，以步距2 μm、最強(qiáng)信號(hào)點(diǎn)為焦平面進(jìn)行斷層掃描。用ZEN軟件將掃描所得的圖像重組成3D圖像[19]。

1.3.4 雙歧桿菌表面疏水性和路易斯酸堿特性的測(cè)定

根據(jù)細(xì)菌粘附溶劑法(bacteria adhesion to the solvent，BATS)方法，并稍作修改[20]。實(shí)驗(yàn)使用的溶劑為氯仿、乙酸乙酯和二甲苯。離心收集雙歧桿菌(6 500×g，5 min)，然后重懸于0.1 mol/L的 KNO3溶液(pH 6.2)中調(diào)節(jié)OD600為0.6。將細(xì)菌懸浮液(3 mL)與每種溶劑(1 mL)充分混合。測(cè)量水相在600 nm處的吸光度(A1)之前，將混合物放置20 min以確保兩相完全分離。雙歧桿菌對(duì)每種溶劑的粘附力按公式(1)計(jì)算：

(1)

疏水性可分為3類：強(qiáng)疏水性(>50%)、中疏水性(20%～50%)和親水性(<20%)[21]。路易斯酸堿特性分為低(<35%)、中(36%～70%)和高(71%～100%)[22]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 16.0進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，(**)P≤0.05,被認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(*)P<0.01，被認(rèn)為數(shù)據(jù)具有顯著差異。使用GraphPad Prism 7軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雙歧桿菌生物膜形成能力分析

為了研究不同雙歧桿菌的生物膜形成差異性，通過微孔板實(shí)驗(yàn)測(cè)定了包括青春雙歧桿菌(n=16)，兩歧雙歧桿菌(n=23)，長雙歧桿菌(n=19)，短雙歧桿菌(n=24)，動(dòng)物雙歧桿菌(n=9)及假小鏈雙歧桿菌(n=23)共114株雙歧桿菌的成膜能力，并以S.mutansATCC 25175作為陽性對(duì)照。結(jié)果如表1所示，所有的兩歧雙歧桿菌菌株都顯示出強(qiáng)成膜性，長雙歧桿菌則普遍表現(xiàn)為弱成膜性，且57.90%菌株為非成膜菌株。而在其他4種雙歧桿菌中，以短雙歧桿菌為例，即使是同一菌種，不同菌株間的成膜能力也表現(xiàn)出顯著差異性：包括HNXY26M4、FJSZJ1M5、ZJHZ13M2、ZJHZD20M12、CCFM622、FFJXM1M3、FSHMX3M在內(nèi)的29.17%的菌株為強(qiáng)成膜性菌株，而CJ1041、HuNan2016 497、 FNMGEL2M1、HuNCS6M1、FHLJDQ3M5等20.83%的菌株為弱成膜性菌株，F(xiàn)BJCP1M6、FBJCP2M1、FAHWH21M7、FFJFZ2M5、CJ653、CJ951、CCFM670、JSWX17M1、HNXY47M8、FFJND26M5、FBJHD5M2、FJSWX21M5等50%的菌株則為非成膜菌株，這種差異性也同樣存在于動(dòng)物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌及假小鏈雙歧桿菌中。由此可見，雙歧桿菌的生物膜形成能力存在一定的種間和株間差異。林炳諭[7]研究認(rèn)為，雙歧桿菌的成膜規(guī)律存在菌株特異性而非菌種特異性，60%的長雙歧桿菌具有成膜能力，與本研究結(jié)果存在差別。由此進(jìn)一步表明，雙歧桿菌的生物膜形成能力具有顯著的菌株差異性，同時(shí)本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌成膜也存在特定的菌種成膜規(guī)律。BUJNAKOVA等[23]發(fā)現(xiàn)除了嗜酸乳桿菌G9表現(xiàn)出非常低的能力外，植物乳桿菌L2-1、發(fā)酵乳桿菌G3和202表現(xiàn)出非常強(qiáng)的生物膜形成能力，發(fā)酵乳桿菌G8、VT1、鼠李糖乳桿菌G10、183、植物乳桿菌85、干酪乳桿菌91表現(xiàn)出中等的生物膜形成能力。由此表明雙歧桿菌和乳桿菌之間生物膜形成能力的差異存在普遍的菌種和菌株特異性。生物膜的形成是一個(gè)具有多個(gè)因素決定的復(fù)雜過程，導(dǎo)致差異的原因值得進(jìn)一步研究。

表1 雙歧桿菌生物膜形成能力Table 1 The biofilm-forming ability of Bifidobacterium

注：-: OD600 nm≤1，不成膜；+: 1

2.2 雙歧桿菌生物膜空間結(jié)構(gòu)差異

為了研究雙歧桿菌生物膜的空間結(jié)構(gòu)，利用SEM揭示了不同的雙歧桿菌生物膜的結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果如圖1所示。成膜菌株形成的生物膜處于多層緊密聚集的狀態(tài)，菌體堆疊的相對(duì)密集且菌體表面附著許多細(xì)胞外聚合物，具有高度組織的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。但是，非成膜雙歧桿菌處于游離狀態(tài)，菌體細(xì)胞的形態(tài)清晰可見。動(dòng)物雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌表現(xiàn)出網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而其他雙歧桿菌則緊密聚集形成厚層。長雙歧桿菌FGSZY16M3(圖1-b)形成的生物膜結(jié)構(gòu)與另外2株長雙歧桿菌不同，它分泌了更多的胞外聚合物將菌體緊密包裹在一起。類似地，短雙歧桿菌ZJHZ13M2形成的生物膜(圖1-g)在結(jié)構(gòu)上也與另外2株長雙歧桿菌表現(xiàn)出一定的差異，其菌體表現(xiàn)出空間表面平鋪以及垂直堆疊的狀態(tài)。這表明雙歧桿菌生物膜空間結(jié)構(gòu)具有一定的種間及株間差異性。TOLKER-NIELSEN等[24]指出，每個(gè)微生物的生物膜結(jié)構(gòu)都是獨(dú)特的，這與我們的發(fā)現(xiàn)相似。生物膜主要由細(xì)菌和胞外多糖組成，胞外多糖被認(rèn)為是生物膜的主要基質(zhì)材料，胞外多糖組成和結(jié)構(gòu)以及含量的不同可能會(huì)對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重大影響[25]。RZHEPISHEVSKA等[26]在研究過程中發(fā)現(xiàn)，在不同材料上銅綠假單胞菌會(huì)形成具有高水平環(huán)狀二鳥苷酸(c-di-GMP)的蘑菇結(jié)構(gòu)和扁平生物膜。

a～d-長雙歧桿菌FBJ11M1，F(xiàn)GSZY16M3，F(xiàn)SHHK13M1，F(xiàn)JSWXJ10M2；e～f-短雙歧桿菌FJSZJ1M5，HNXY26M4，ZJHZ13M2，F(xiàn)BJCP1M6；i～l-動(dòng)物雙歧桿菌AHWH4M1，F(xiàn)GZ9I1M8，F(xiàn)JSSZ6M5，HuNDA2M3；m～p-青春雙歧桿菌FSDJN12W5，M1DZ09M1，HuNan2016M112，Z25；q～t-假小鏈雙歧桿菌FSCDJY13M4，F(xiàn)JLHD4M2，F(xiàn)FJNDD5M3，F(xiàn)QHXN5M4；u～w-兩歧雙歧桿菌JSWX232，F(xiàn)SDJN7O5，M12901M5圖1 雙歧桿菌生物膜的SEM(×3 000)圖Fig.1 SEM(×3 000) images of biofilms formed byBifidobacterium

2.3 雙歧桿菌生物膜活、死菌分布差異

為了研究不同雙歧桿菌生物膜的活性，利用CLSM揭示了生物膜活死菌分布的差異性，結(jié)果如圖2所示。長雙歧桿菌FGSZY16M3(圖2-b)、FSHHK13M1(圖2-c)、短雙歧桿菌HNXY26M4(圖2-e)、兩歧雙歧桿菌JSWX232(圖2-p)、FSDJN7O5(圖2-q)和M129R01M5(圖2-r)形成的生物膜基本上沒有死菌(綠色)，表明這些生物膜具有較高的活性。但是其他生物膜具有不同比例的死亡細(xì)菌(紅色)，生物膜活性相應(yīng)減弱。總體而言，活細(xì)菌的比例高于死細(xì)菌，但活菌與死菌的比例在不同菌株的生物膜之間有所不同。

a～c-長雙歧桿菌FBJ11M1，F(xiàn)GSZY16M3，F(xiàn)SHHK13M1；d～f-短雙歧桿菌FJSZJ1M5，HNXY26M4，ZJHZ13M2；g～i-動(dòng)物雙歧桿菌AHWH4M1，F(xiàn)GZ9I1M8，F(xiàn)JSSZ6M53；j～l-青春雙歧桿菌FSDJN12W5，M1DZ09M1，HuNan2016M112；m～o-假小鏈雙歧桿菌FSCDJY13M4，F(xiàn)JLHD4M2，F(xiàn)FJNDD5M3；p～r-兩歧雙歧桿菌JSWX232，F(xiàn)SDJN7O5，M12901M5圖2 雙歧桿菌生物膜活死菌分布的CLSM圖Fig.2 CLSM images of the distribution of live and deadbacteria in biofilms formed by Bifidobacterium

2.4 雙歧桿菌表面疏水性及路易斯酸堿特性對(duì)其成膜的影響

為了進(jìn)一步探究影響雙歧桿菌生物膜形成的限制因素，利用BATS法測(cè)定了雙歧桿菌表面疏水性及路易斯酸堿特性，并與其成膜能力進(jìn)行相關(guān)性分析。研究發(fā)現(xiàn)，短雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌和青春雙歧桿菌的表面疏水性和路易斯酸特性與其成膜能力呈正相關(guān)(rs分別為0.432、0.7、0.791、0.448、0.783、0.674)。從圖3可以看出，短雙歧桿菌CJ951和CJ653以及動(dòng)物雙歧桿菌CCFM624等菌株具有與成膜菌株相似的特性，但卻不具備生物膜形成能力。此外，假小鏈雙歧桿菌的生物膜形成能力也與路易斯酸特性呈正相關(guān)性(rs=0.348)。長雙歧桿菌的生物膜形成能力普遍較弱，并且成膜菌株與非成膜菌株表面特性沒有顯著差異。表面性質(zhì)與生物膜形成能力之間沒有相關(guān)性(rs分別為-0.179、0.139、-0.086，P>0.05)。所有兩歧雙歧桿菌都顯示出很強(qiáng)的生物膜形成能力，具有較高的表面疏水性和路易斯酸特性，且表面路易斯堿特性也高于其他雙歧桿菌。然而，相關(guān)性分析表明，兩歧雙歧桿菌表面特性與其生物膜形成能力之間沒有相關(guān)性(rs分別為-0.141、0.183、103，P>0.05)。

a-長雙歧桿菌；b-短雙歧桿菌；c-動(dòng)物雙歧桿菌；d-青春雙歧桿菌；e-兩歧雙歧桿菌；f-假小鏈雙歧桿菌圖3 雙歧桿菌表面疏水性和路易斯酸堿特性Fig.3 Hydrophobicity and Lewis acid-base characteristics of Bifidobacterium strains

因此，雙歧桿菌表面特性與其成膜能力具有一定的正相關(guān)性，但是相關(guān)性在種水平上有所不同。由于菌株的生長方式、階段和培養(yǎng)基成分等的不同，疏水性在菌種和菌株之間甚至在同一菌株上也有所不同[27]。當(dāng)菌株表面的疏水性不同時(shí)，疏水相互作用將相應(yīng)地改變，從而導(dǎo)致生物膜形成能力的差異。AMBALAM等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在膽汁的刺激下雙歧桿菌的疏水性及成膜能力都有所增強(qiáng)。此外，MAZUMDER等[29]也發(fā)現(xiàn)，高疏水性的突變菌株在各種材料表面的生物膜形成能力均高于野生型菌株。路易斯酸堿相互作用涉及細(xì)菌壁接近聚合物基質(zhì)時(shí)可能發(fā)生的離子轉(zhuǎn)移、共價(jià)鍵轉(zhuǎn)移或氫鍵轉(zhuǎn)移[30]。電子受體或供體元素組的差異會(huì)影響路易斯酸堿特性的大小，從而導(dǎo)致細(xì)菌與載體表面的粘附和隨后的生物膜形成差異。SAMOT等[31]研究發(fā)現(xiàn)，一些黏附性好的菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的給電子能力。

表2 雙歧桿菌表面特性與其成膜能力的Spearman相關(guān)性Table 2 Spearman's correlations among Bifidobacteriumsurface characteristics and biofilm-forming ability

注：**，P<0.01;*，P<0.05

3 結(jié)論

本文研究了青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌及假小鏈雙歧桿菌共114株雙歧桿菌的生物膜成膜特性，研究表明雙歧桿菌生物膜的形成能力存在一定的種間和株間差異性，兩歧雙歧桿菌為強(qiáng)成膜菌株，長雙歧桿菌為弱成膜菌株，而短雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌及假小鏈雙歧桿菌的成模性存在菌株差異。不同雙歧桿菌形成的生物膜空間結(jié)構(gòu)不同，動(dòng)物雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌的生物膜表現(xiàn)為蘑菇結(jié)構(gòu)，長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和假小鏈雙歧桿菌所形成的生物膜則是扁平狀的。此外，研究還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌表面疏水性及路易斯酸堿特性與其成膜能力呈一定的正相關(guān)性，但這種相關(guān)性在菌種水平上顯著不同。短雙歧桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌和青春雙歧桿菌表面疏水性及路易斯酸特性與其成膜能力呈正相關(guān)性，假小鏈雙歧桿菌的成膜能力僅與其路易斯酸特性有關(guān)，而長雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌成膜能力與其表面特性無關(guān)。