乳酸乳球菌NZ9000中增強型綠色熒光蛋白報告系統的構建

劉璐，艾連中，夏永軍，熊智強，管彤，宋馨

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

乳酸菌因發酵糖類產生大量乳酸而得名，是一類不產孢子，過氧化氫酶促反應為陰性，培養條件為厭氧或兼性厭氧的原核微生物[1-3]。部分乳酸菌通過產生乳酸、醋酸、苯乳酸、細菌素等代謝產物而顯示出抗菌活性，可抑制致病菌和腐敗菌的繁殖，防止食品發生腐敗變質，通常被用作食品的天然生物防腐劑[4-5]，在乳制品、泡菜等發酵食品中有著悠久的應用歷史。

乳酸乳球菌是乳酸菌屬中重要成員之一，由于基因組相對較小，在基因工程及代謝方面已成為理想的模式菌株[6]、微生物細胞工廠[7]、口服疫苗傳遞載體[8]、異源蛋白質生產的宿主[9]。近年來，利用分子生物學手段可以在乳酸乳球菌中過表達外源基因，賦予宿主新的生物特性。在乳酸菌的表達系統中，外源蛋白的表達離不開啟動子的調控。啟動子是基因表達重要的調控元件，決定了基因表達的強度和時機，啟動子的強弱，決定了蛋白質表達量的多少[10]。啟動子根據作用方式分為不同的類型：一種是不受調節因子或生長條件限制，可持續表達的組成型啟動子；一種是驅動細胞適應外界環境進行基因表達，需要添加誘導物的誘導型啟動子[7]。隨著現代生物技術的發展，人工合成啟動子的出現實現了對代謝工程更精細的調控且有助于基因低水平的表達[11]。

本文以增強型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein，eGFP)基因為報告基因，將人工合成啟動子P11、組成型啟動子P23、P32、P44分別克隆至報告質粒中，利用電轉化得到攜帶目標質粒的陽性轉化子，接著利用酶標儀對各啟動子調控的eGFP進行表達強度的定量分析，以此表征各啟動子的轉錄活性，從中篩選出乳酸乳球菌中具有較強轉錄活性的啟動子。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及培養條件

本文所用菌株、質粒見表1。LB(Luria-Bertani)培養基用于大腸桿菌(Escherichiacoli)的培養，配方(g/L)如下：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、NaCl 10、瓊脂粉15。乳酸乳球菌的培養基為GM17培養基，配方( g/L)：胰蛋白胨 5、大豆蛋白胨5、牛肉膏5、酵母浸出粉2.5、β-磷酸甘油二鈉19、MgSO4·7H2O 0.25、葡萄糖5、瓊脂粉(Agar)15。上述培養基若為液體培養基，則不加瓊脂粉。篩選標記為紅霉素(erythromycin)，大腸桿菌工作質量濃度為300 μg/mL；乳酸乳球菌工作質量濃度為10 μg/mL。復蘇培養基：含2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的GM17液體培養基。20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)：2.432 g Tris溶于1 L滅菌去離子水中，用HCl調節pH至7.4。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

1.2 主要試劑及儀器

PCR高保真酶PrimeSTAR HS(Premix)、Premix TaqTM、限制性內切酶PstI、BamHI、ApaI、EcoRI、BglII及T4DNA Polymerase、T4DNA Ligase、DNA Marker，Takara寶生物工程(大連)有限公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；KOD FX Neo，日本Toyobo公司；割膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒，Axygen公司；紅霉素、瓊脂糖、Tris，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑，國藥集團，分析純。利用Vector NTI設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

注：下劃線代表酶切位點

S1000TMThermal Cycler PCR儀、Powerpac basic凝膠電泳儀、凝膠成像儀、MicroPulser電擊轉化儀、2 mm電轉杯，美國Bio-Rad公司；超微量核酸蛋白定量儀Nanodrop 2000/2000c，Thermo Fisher Scientific公司；高速冷凍離心機，德國Sigma公司；Spectra Maxi3x酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1E.coliTop10感受態細胞的制備

(1)取凍藏于-80 ℃冰箱的甘油管E.coliTop10劃線于LB固體平板，37 ℃培養箱靜置培養12～16 h，單菌落狀態直徑為1～2 mm。

(2)挑取單菌落，接種至裝有4 mL LB液體培養基的試管中，于37 ℃下200 r/min搖床振蕩培養12～16 h。

(3)以1%的接種量接種至裝有50 mL LB液體培養基的250 mL錐形瓶中，于37 ℃下200 r/min搖床振蕩培養至OD600值為0.3～0.5。轉移至50 mL離心管中，冰上靜置10 min。于4 ℃下4 500 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清液。

(4)用預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重懸洗滌細胞2次，4 ℃下4 500 r/min離心2～5 min，收集菌體，棄上清液。重懸于預冷的0.1 mol/L CaCl2-10%甘油溶液中。每100 μL感受態細胞分裝于預冷的1.5 mL EP管中，凍藏于-80 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 表達質粒的構建

以pMG36e、pNZ44質粒為模板，P32-F/R，P44-F/R為引物，分別進行PCR擴增，獲得啟動子片段P32、P44。以pLpCas9-0537、pIB184-eGFP為模板，pIB184-P11-F、P11-eGFP-R，eGFP-P11-F、eGFP-R為引物，分別擴增獲得片段P11、eGFP。再以片段P11、eGFP為模板，pIB184-P11-F、eGFP-R為引物進行overlap PCR，獲得片段eGFP-P11。PCR反應程序如下：95 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s(PCR擴增用高保真酶PrimeSTAR HS；若PCR驗證用Premix TaqTM，退火時間為30 s)，72 ℃延伸1 min/kb；變性至延伸循環30次，72 ℃總延伸10 min。

用PstI/BamHI、ApaI/EcoRI分別雙酶切pIB184-eGFP骨架，將酶切后的DNA片段進行1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收6 565、5 880 bp片段，獲得線性化載體；啟動子片段P32、P44，eGFP-P11分別與PstI/BamHI、ApaI/EcoRI雙酶切后的線性化載體骨架經Clon Express II One Step Cloning Kit無縫克隆連接，以構建帶有不同啟動子的質粒。

經PstI/BamHI雙酶切線性化載體pIB184-eGFP，70 ℃金屬浴5 min，使限制性內切酶失活，冷卻至室溫后加入dNTPs、T4DNA Polymerase，37 ℃保溫40～60 min，割膠回收，T4DNA Ligase連接，16 ℃金屬浴4～5 h，以構建不含啟動子的空載對照。

將以上連接產物及對照分別轉化至100 μLE.coliTop10感受態細胞，冰上靜置30 min，42 ℃水浴45～90 s，冰浴2～5 min后加入37 ℃預熱的900 μL LB液體培養基，37 ℃下200 r/min搖床復蘇1 h，涂布于含有紅霉素的LB固體培養基，37 ℃靜置培養 12～24 h。挑取轉化子進行菌落PCR驗證，分別用引物P32-F/R，P44-F/R，pIB184-P11-F、eGFP-R，pIB184-eGFP-F/R驗證pLL06、pLL07、pLL37、pLL15。驗證正確的轉化子接種于液體LB+Em培養基擴大培養，37 ℃下200 r/min搖床培養12～16 h，按照Axygen公司質粒DNA提取試劑盒中說明書抽提質粒，進一步酶切驗證。挑選酶切片段正確的質粒，送至上海生工生物工程有限公司測序。以上質粒分別命名為pLL06(攜帶P32啟動子)、pLL07(攜帶P44啟動子)、pLL37(攜帶P11啟動子)、pLL15(無啟動子)。

1.3.3 乳酸乳球菌的轉化

將pLL06、pLL07、pLL37、pLL15及pIB184-eGFP分別電轉至乳酸乳球菌NZ9000感受態細胞中，每100 μL細胞中轉化200 ng左右的質粒，感受態細胞制備及轉化方法參照文獻[12]進行，復蘇后涂布于含有紅霉素的GM17固體平板，30 ℃靜置培養24～36 h后挑取轉化子進行菌落PCR驗證，分別用引物P32-F、pIB184-eGFP-R，P44-F、pIB184-eGFP-R，pIB184-P11-F、eGFP-R，pIB184-eGFP-F/R驗證pLL06、pLL07、pLL37、pLL15。陽性轉化子命名為L.lactisNZ9000-pLL06、L.lactisNZ9000-pLL07、L.lactisNZ9000-pLL37、L.lactisNZ9000-pLL15、L.lactisNZ9000-pIB184-eGFP。PCR反應程序如下：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s(KOD FX Neo)，68 ℃延伸30 s/kb；變性至延伸循環30次，68 ℃總延伸10 min。

1.3.4 熒光強度的測定

將L.lactisNZ9000-pLL06、L.lactisNZ9000-pLL07、L.lactisNZ9000-pLL37、L.lactisNZ9000-pLL15、L.lactisNZ9000-pIB184-eGFP分別劃線活化，挑取單菌落轉接至GM17+Em液體培養基中。30 ℃靜置培養至對數期，1.5 mL菌液于12 000×g下離心1 min，棄上清液；20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)洗滌2次后重懸菌體，混勻后每個樣品取100 μL加入96孔板。在激發波長480 nm、發射波長525 nm下，用酶標儀測eGFP的表達強度及OD600值。每個樣品3個平行測定[13]。

2 結果與分析

2.1 目的基因片段的擴增

分別以pMG36e、pNZ44為模板，引物P32-F/R、P44-F/R擴增啟動子P32、P44，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示。

M-DL 500 DNA Marker; 1～3-啟動子P32; 4～6-啟動子P44圖1 PCR擴增啟動子P32、P44Fig.1 PCR amplified the promter of P32, P44

泳道1～6在近300 bp處有特異性清晰條帶，與啟動子P32、P44片段大小287、288 bp相符。以pLpCas9-0537、pIB184-eGFP為模板，引物pIB184-P11-F、P11-eGFP-R，eGFP-P11-F、eGFP-R分別擴增片段P11、eGFP。如圖2所示，泳道1～3是P11的PCR條帶93 bp(圖2-a)。在750 bp處有明亮的條帶，與eGFP片段772 bp的大小相符(圖2-b)。片段P11及eGFP經overlap PCR后在瓊脂糖凝膠1 000和750 bp間有單一條帶，與819 bp的eGFP-P11片段大小相符(圖2-c)。

a-M-DL 500 DNA Marker, 1～3-PCR擴增P11;b-M-DL 2000 DNAMarker, PCR擴增eGFP;c-M-DL 2000 DNA Marker,1～3-overlap擴增eGFP-P11圖2 PCR擴增P11、eGFP、eGFP-P11Fig.2 PCR amplified the fragment P11, eGFP and eGFP-P11

2.2 酶切載體的獲得

用PstI/BamHI、ApaI/EcoRI分別雙酶切質粒pIB184-eGFP，將線性化的DNA片段6 565、5 880 bp進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。如圖3-a所示，1～2為質粒pIB184-eGFP經PstI/BamHI雙酶切出6 565、239 bp(圖中未顯示)的條帶。圖3-b中，1為質粒pIB184-eGFP經ApaI/EcoRI雙酶切出5 880、924 bp的條帶。

a-M-DL 15000 DNA Marker, Pst I/BamH I酶切pIB184-eGFP;b-M-DL 10000 DNA Marker, Apa I/EcoR I酶切pIB184-eGFP圖3 雙酶切載體pIB184-eGFPFig.3 Double enzyme digested the vector pIB184-eGFP

2.3 重組質粒的構建及鑒定

分別挑取pLL06、pLL07、pLL37、pLL15轉化子進行菌落PCR驗證。如圖4-a所示，泳道1～2為pLL07的插入片段P44的驗證結果，泳道3～4為pLL06的插入片段P32的驗證結果。圖4-b是pLL37的插入片段eGFP-P11驗證結果，均與預期片段大小相符。挑菌落PCR驗證正確的單菌落，轉接至液體培養基，過夜培養后收集菌體提質粒，進一步進行酶切驗證。如圖5-a所示，泳道1為pLL06經PstI/BglII雙酶切，獲得5 816、1000 bp的條帶；泳道2為pLL07經PstI/EcoRI雙酶切，獲得5 827、990 bp的條帶；泳道3為pLL37經ApaI/EcoRI雙酶切，獲得5 880、773 bp的條帶。圖5-b中，泳道1為EcoRI單酶切pLL15，片段大小為6 551 bp；泳道2為對照質粒pIB184-eGFP經EcoRI單酶切，片段大小為6 804 bp。酶切出的片段大小均與預期相符，說明pLL06、pLL07、pLL15、pLL37系列質粒構建成功。

a-M-DL 500 DNA Marker; 1～2-pLL07; 3～4-pLL06;b-M-DL 1000 DNA Marker; 1～4-pLL37圖4 PCR驗證pLL06、pLL07、pLL37Fig.4 PCR verified pLL06, pLL07 and pLL37

M-DL 10000 DNA Marker; a-1-pLL06; 2-pLL07; 3-pLL37;b-1-pLL15; 2-對照pIB184-eGFP圖5 酶切驗證不同啟動子的質粒Fig.5 Identification of plasmids of different promotersby enzyme digestion

2.4 熒光強度的測定

將重組質粒pLL06、pLL07、pLL37、pIB184-eGFP及pLL15電轉至乳酸乳球菌NZ9000感受態細胞中，挑取單菌落進行PCR驗證。如圖6-a所示，泳道1～3為pLL15用引物pIB184-eGFP-F/R進行驗證，片段大小為863 bp；泳道4～6為pLL07用引物P44-F、pIB184-eGFP-R進行驗證，片段大小為993 bp；泳道7～8為pLL06用引物P32-F、pIB184-eGFP-R進行驗證，片段大小為992 bp。如圖6-b所示，pLL37用引物pIB184-P11-F、eGFP-R進行驗證，片段大小為819 bp。結果顯示所有重組質粒均成功轉化至乳酸乳球菌NZ9000中。挑選陽性轉化子，測量對數期不同啟動子調控eGFP的表達強度，如圖7所示。結果表明，啟動子P11的活力十分微弱，啟動子P23、P32、P44分別比P11高約23.9、7.8、4.1倍。

a-M-DL 2000 DNA Marker; 1～3-pLL15; 4～6-pLL07;7～8-pLL06;b-M-DL 1000 DNA Marker; 1～2-pLL37圖6 PCR驗證NZ9000-pLL06、pLL07、pLL15、pLL37Fig.6 PCR verified NZ9000-pLL06, pLL07, pLL15and pLL37

圖7 利用基于eGFP的報告系統對不同啟動子強度的測定Fig.7 Evaluation of the transcriptional activities of differentpromoters via an eGFP reporting system注：圖中不同字母表示存在極顯著性差異(P<0.01)

3 結果與討論

在乳酸乳球菌中，蛋白質的表達可通過組成型啟動子進行調控使基因持續性表達，也可通過誘導型系統添加誘導肽誘導相應啟動子發揮活性以調控相應蛋白的表達，如Nisin-controlled expression system[14]，Sugar-inducible expression system[15]。誘導型系統可以降低毒性蛋白產生的毒性，避免細胞死亡，但系統的表達需要添加誘導肽，不易調控，操作繁瑣。pIB184是廣宿主大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒，常用做乳酸菌過表達質粒載體[16-17]。為篩選出易于調控、適用于乳酸乳球菌、啟動強度高的啟動子，本研究以eGFP為報告基因、pIB184質粒為骨架，建立了乳酸乳球菌NZ9000報告系統。通過無縫克隆的方式，獲得一系列攜帶不同啟動子的重組質粒，并將其分別轉化至乳酸乳球菌中。利用酶標儀測定eGFP的表達強度，比較啟動子P11、P23、P32、P44在乳酸乳球菌NZ9000中調控基因表達能力的強弱。結果表明啟動子P11轉錄活性較弱，這可能是由于乳酸菌對啟動子具有嚴格的宿主選擇性[18-19]。啟動子P23轉錄活性最強，這與VOSSEN等[20]在乳脂鏈球菌中的研究結果一致。宋馨[13]在干酪乳桿菌中對P23與Pcas、PJ23119、Pldh進行了比較，結果表明P23調控eGFP表達的能力最強。因此，推斷P23是目前應用在乳酸菌中轉錄活性最強的啟動子。本研究建立了乳酸乳球菌適用的報告系統，可被應用于篩選不同轉錄活性的啟動子。同時利用該系統，鑒定了不同啟動子在乳酸乳球菌中的轉錄活性，獲得了不同強度的啟動子，為外源基因在乳酸乳球菌中的表達奠定了基礎。