牛血清蛋白與鄰苯二酚、間苯三酚相互作用的機理探究

褚千千，艾健，方佳琪，韓秋煜，包斌，2*，孫永軍

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306) 3(好當家集團有限公司，山東 榮成，264305)

蛋白質不僅為人類提供了必需的營養物質，并且在食品加工中具有膠凝、乳化、起泡、水結合等多種功能性質[1-3]。一些蛋白質由于受固有結構的限制，導致其功能性質缺乏，或者由于環境條件變化、食品加工處理，功能性質也會受到負面影響[4-6]。為了改善蛋白質的功能性質，可以在含蛋白質食品中添加一些外源性成分，以更好地滿足加工業的需求，例如酚類化合物、淀粉、非肌肉蛋白、轉谷氨酰胺酶等[7-9]。酚類化合物由于具有抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等多種生物活性[9-10]，而被應用于食品、藥品中。一些學者研究發現植物多酚提取物可以作為魚糜凝膠的增強劑[10-13]，改善魚糜制品的口感和質地。PRIGENT等[14]發現原花青素可以改善球蛋白(牛血清蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白)的泡沫穩定性。ALU′DATT等[15]研究發現,從亞麻籽蛋白質分離物中去除游離和結合的酚類化合物降低了亞麻籽蛋白的熱穩定性、持水性和黏彈性。

近年來關于酚類化合物與蛋白質相互作用的機理逐漸成為研究熱點，有學者探究了氧化的單寧酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸等與蛋白質的共價結合[16-18]，推測這些酚類化合物被氧化后可以形成相應的醌類物質，氨基酸側鏈和醌之間的反應可能導致蛋白質分子聚合，從而形成復合物，進而影響蛋白質功能性質[19]。也有學者提出酚類化合物也可以與蛋白質發生非共價相互作用[20-21]，徐潔瓊等[22]探究了熱加工處理對β-乳球蛋白與酚酸(綠原酸、咖啡酸、阿魏酸)間相互作用的影響。

前期有研究表明，褐藻多酚提取物能夠提高魚糜凝膠的破斷力和凝膠強度[23]，說明褐藻多酚和魚糜蛋白質發生了反應。褐藻多酚是間苯三酚的脫氫聚合物，有時帶有額外的鹵素或羥基[24]。為了進一步研究褐藻多酚與蛋白質之間的反應機理，本文選擇其單體酚——間苯三酚 (m-trihydroxybenzene，MP) 作為研究對象，同時選擇與間苯三酚結構相近的鄰苯二酚(o-dihydroxybenzene，OP) 作為比較。RAWEL等[25]提出，牛血清蛋白 (bovine serum protein，BSA)由于具有較高的分子量，并且可以與酚類化合物形成可溶性復合物，適合用于這類機理的研究。因而本文先將OP、MP進行氧化，將氧化和未氧化的OP、MP與BSA進行反應，從共價相互作用和非共價相互作用2個角度比較研究BSA與鄰苯二酚、間苯三酚相互作用的機理，以期為酚類化合物在開發健康和營養食品中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

BSA(優級純)，上海美倫生物科技有限公司；OP、MP，均為優級純，國藥集團化學試劑有限公司；三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid, TNBS)，美國Sigma公司；L-亮氨酸、NaCl、尿素、溴化鉀、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaHSO3，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；2-硝基苯甲酸、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)，分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司。

UV1102紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司； Synergy2多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；96孔酶標板，上海康寧有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋，深圳市超杰生物科技有限公司；真空冷凍干燥機、NICOLET iS5傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)，美國Thermo公司；高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Chirascan圓二色譜(circular dichroism, CD)，英國Leatherhead公司；差示掃描量熱儀 (differential scanning calorimeter, DSC)，美國TA儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 酚類化合物-蛋白質復合物的制備

參考RAWEL等[26]的方法制備酚類化合物-蛋白質復合物，略有改動。

氧化鄰苯二酚-牛血清蛋白 (OOP-BSA)、氧化間苯三酚-牛血清蛋白 (OMP-BSA) 復合物的制備：將10 g/L的鄰苯二酚、間苯三酚水溶液用NaOH調pH為9，暴露于空氣中在 25 ℃的條件下連續攪拌氧化24 h。分別取2 mL氧化的鄰苯二酚、間苯三酚水溶液加入到20 mL 1 mg/mL的BSA水溶液中，反應2 h。

鄰苯二酚-牛血清蛋白(OP-BSA)、間苯三酚-牛血清蛋白(MP-BSA) 復合物的制備：分別取2 mL 10 g/L的鄰苯二酚、間苯三酚水溶液加入到20 mL 1 mg/mL的BSA水溶液中，加入液體石蠟液封以隔絕氧氣，反應2 h。

對照組：取2 mL 超純水加入到20 mL 1 mg/mL的BSA水溶液中。

將上述反應后的復合物及對照組透析24 h，每隔4 h換一次水，以除去未反應的酚類化合物。取一部分透析液進行真空冷凍干燥，備用。剩下的透析液用做液體樣品。

1.2.2 游離氨基含量的測定

參照CROWELL[27]采用TNBS的方法測定樣品中游離氨基含量的變化，略有改動。取待測溶液125 μL，加入1 mL pH 8.2的磷酸緩沖溶液及1 mL 1 g/L TNBS，將混合好的樣品置于50 ℃的暗處搖勻1 h。將樣品取出后加入2 mL 0.1 mol/L的NaHSO3，至于暗處，30 min后于420 nm下測吸光值。以0.1～0.5 mmol/L 濃度的L-亮氨酸作標準曲線來定量游離氨基含量。

1.2.3 巰基含量的測定

參照BEVERIDGE等[28]的方法，準確稱取0.4 g DTNB于100 mL Tirs-Gly緩沖溶液 (每升溶液含10.4 g Tirs，6.9 g Gly，1.2 g EDTA，pH 8) 中，配制成4 mg/mL的Ellman’s試劑。取0.5 mL樣品加入2 mL 8 mol/L尿素 (溶于Tirs-Gly緩沖溶液) 及40 μL Ellman’s試劑，在室溫下放置1 h后于412 nm處測吸光度，巰基的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：S,疏基含量，μmol/g;73.53來自106/(1.36×104)，106表示從摩爾基礎到μmol/mL基礎以及從mg固體到g固體的轉化率，1.36×104是摩爾吸光系數，L/(mol·cm);D,稀釋倍數;ρ,蛋白質量濃度，mg/mL。

1.2.4 OP、MP與BSA非共價相互作用力的測定

離子鍵的含量以溶解于A、B溶液中蛋白質含量之差來表示；氫鍵以溶解于B、C溶液中蛋白質的含量之差來表示；疏水性相互作用以溶解于C、D溶液中蛋白質的含量之差來表示。

1.2.5 表面疏水性的測定

參照文獻[30]的方法，略有改動。以ANS試劑為熒光探針，將樣品用磷酸緩沖液 (0.01 mol/L，pH 7.0) 稀釋為5個蛋白終濃度 (0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL)。取2 mL上述稀釋液加入40 μL 8 mmol/L ANS溶液，室溫下放置15 min。用 Synergy 2多功能酶標儀在激發光波長360 nm、發射光波長460 nm下測定樣品的熒光強度。同時，分別以相同濃度的鄰苯二酚、間苯三酚溶液作為試劑空白。最后，以熒光強度對BSA濃度作圖進行線性分析，所得曲線斜率即為該樣品的蛋白質表面疏水性。

1.2.6 酚類化合物-蛋白質復合物構象的表征

1.2.6.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法進行FTIR分析。分別取凍干后的對照組樣品和復合物1 mg加入適量的KBr，用瑪瑙研缽研磨成均勻細粉狀，壓片。掃描條件：波數范圍4 000～650 cm-1，次數16 次，分辨率為4 cm-1。采用KBr做空白對照，每個樣品在相同條件下重復3次取平均值。

使用OMNIC 9軟件, 對樣品譜圖進行修整校正。剪切蛋白質酰胺Ⅰ帶 (1 600～1 700 cm-1) 的數據在Peakfit 4.12軟件中進行基線校正，去卷積，采用Gausse函數進行二階導數擬合，直至擬合相關系數R2≥0.99, 且穩定不再變化, 確定各子峰與各二級結構的對應關系, 計算各子峰面積的相對百分含量。

1.2.6.2 圓二色譜分析

通過圓二色譜儀對酚類化合物-蛋白質復合物中蛋白質的二級結構進行分析。測定在室溫且持續通氮氣的條件下進行，掃描速度100 nm/min，帶寬1.0 nm,路徑長度0.5 mm。將樣品濃度稀釋到0.1 mg/mL，在190～260 nm范圍內進行測定，平均測定3次。

1.2.6.3 變性溫度分析

采用差式掃描量熱法，參考曹艷蕓[31]的方法，稱取 5 mg 左右凍干的對照組樣品和復合物，置于鋁制坩堝中。加熱溫度范圍為20～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min。空樣品坩堝作為空白對照。用 Universal analysis分析軟件 (TA公司) 計算樣品在升溫過程中的最大轉變溫度。

1.2.7 統計與分析

本文實驗所有樣品均為3組平行。作圖采用OriginPro 9.1軟件，采用SPSS statistic 22.0進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 鄰苯二酚和間苯三酚對BSA游離氨基和巰基的影響

BSA與酚類化合物反應前后游離氨基和巰基含量如表1所示。與對照相比，OOP-BSA、OMP-BSA復合物中游離氨基和巰基的含量均顯著降低(P<0.05)，并且OOP-BSA的降低量大于OMP-BSA。說明氧化的鄰苯二酚、間苯三酚與牛血清蛋白的游離氨基、巰基發生共價反應，而且該反應與酚羥基的反應活性有關。OP由于其羥基取代的高反應性，很容易被氧化，在O2存在的堿性條件下即可進行自動氧化[32]。OP被氧化成相應的鄰苯二醌，醌是一種反應性親電子中間體，可能會和BSA氨基酸側鏈中的游離氨基、巰基發生反應，形成C—N或C—S共價鍵。氨基酸側鏈和醌之間的反應會導致蛋白質分子的聚合，從而形成復合物[33]。但是對于間苯三酚來說，MP不能被氧化成相應的醌，而是形成了半醌自由基[34]，半醌自由基可以攻擊親核反應配偶體，從而和BSA的游離氨基、巰基反應，形成復合物。半醌自由基的反應活性低于醌，因而導致OOP-BSA復合物游離氨基和巰基較BSA的降低量大于OMP-BSA復合物。RAWEL等[35]比較了鄰苯二酚、間苯二酚與溶菌酶的共價反應活性，結果顯示鄰苯二酚的反應活性更高。對于未氧化的鄰苯二酚和間苯三酚而言，OP-BSA、MP-BSA復合物中游離氨基和巰基的含量較對照均沒有顯著性變化(P<0.05)，進一步說明了酚類化合物只有在被氧化形成醌或半醌自由基后才能與蛋白質發生共價反應。

表1 BSA及其復合物的游離氨基與巰基含量(n=3)Table 1 Free amino and sulfhydryl content of BSA andits complexes

2.2 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA之間的非共價相互作用力分析

KANG等[36]提出綠原酸和阿魏酸與人血清蛋白的非共價相互作用主要包括芳香環與疏水氨基酸殘基之間的疏水力，羧酸鹽基團與堿性氨基酸殘基之間的靜電力以及羥基與多肽鏈之間的氫鍵。鑒于未氧化的OP、MP不能和BSA發生共價相互作用，因而對OP、MP和BSA之間的非共價相互作用進行探究 (圖1)。酚類化合物和蛋白質之間的非共價相互作用包括5種類型：氫鍵，疏水相互作用，靜電相互作用，范德華力和離子鍵[37]。其中氫鍵和疏水相互作用被認為是酚類化合物和蛋白質之間相互作用的主要驅動力[38]。從圖1可見，和對照相比，OP-BSA、MP-BSA離子鍵沒有顯著變化(P<0.05)，說明OP、MP未與BSA形成新的離子鍵。氫鍵含量顯著升高(P<0.05)，并且MP-BSA的增加量大于OP-BSA。因為酚基團是一種優良的氫供體，很容易與蛋白質的羧基形成氫鍵，從而導致OP-BSA、MP-BSA復合物中氫鍵含量升高，并且間苯三酚的羥基數量大于鄰苯二酚，因而與BSA形成更多的氫鍵。OP-BSA的疏水相互作用較對照顯著提高(P<0.05)，而MP-BSA的疏水相互作用顯著下降。酚類化合物中的芳基和BSA分子內部的疏水性基團發生聚集，降低了其結合水的能力，疏水相互作用增強[39]，而MP由于含有較多的羥基，羥基是一種親水性基團，羥基的親水性可能會阻礙芳基和BSA疏水性基團的聚集，也可能是氫鍵成為了MP和BSA之間相互作用的主要驅動力，因而導致MP-BSA中疏水相互作用降低。

圖1 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA的非共價相互作用Fig.1 Effect of OP and MP on the interaction force of BSA注：上標不同字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 鄰苯二酚、間苯三酚對BSA表面疏水性的影響

蛋白質的表面疏水性變化可以反映蛋白質與水、其他化學物質產生作用時的實際情況[40]。氧化與未氧化的鄰苯二酚、間苯三酚對BSA表面疏水性的影響如圖2所示，與對照相比，OP、MP、OOP、OMP的引入都會使BSA的表面疏水性顯著降低 (P<0.05)，這說明酚類化合物與BSA的疏水性氨基酸發生了反應。RAWEL等[41]討論了氧化鄰苯二酚在色氨酸的雜環N-原子上發生反應的可能性，證實了酚類化合物被氧化成醌后和蛋白質色氨酸發生了共價反應，導致蛋白質表面疏水性降低。而未氧化的酚類化合物的氫原子也很容易和色氨酸的氮原子形成分子間氫鍵，發生非共價相互作用。圖2顯示OOP-BSA、OMP-BSA復合物的表面疏水性顯著低于OP-BSA、MP-BSA復合物，說明相較非共價反應，蛋白質如果與酚類化合物發生共價反應，會對蛋白質的表面疏水性產生更大的影響。另一方面，OP-BSA、OOP-BSA復合物表面疏水性顯著低于MP-BSA、OMP-BSA復合物，說明鄰苯二酚對蛋白質表面疏水性的影響大于間苯三酚。

圖2 鄰苯二酚、間苯三酚對BSA表面疏水性的影響Fig.2 Effect of OP and MP on the surfacehydrophobicity of BSA

2.4 鄰苯二酚、間苯三酚對BSA二級結構的影響

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA相互作用的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of interaction between OP,MP and BSA

與BSA比較，4種復合物在酰胺I和酰胺II帶也發生了位移，說明BSA與鄰苯二酚、間苯三酚的相互作用伴隨著蛋白質二級結構的變化。對酰胺I (1 600～1 700 cm-1) 的光譜進行高斯擬合，得到二級結構含量，如表2所示。OP-BSA、OOP-BSA、MP-BSA、OMP-BSA復合物中α-螺旋含量分別降低15.40%、15.60%、16.00%、16.00%， β-折疊分別上升25.60%、28.90%、18.20%、14.00%，β-轉角分別上升7.10%、5.90%、7.70%、17.20%，無規則卷曲分別上升5.10%、5.60%、1.20%、3.40%。表明引入氧化和未氧化的OP、MP都會破壞BSA的二級結構，并且OP、OOP對BSA二級結構的影響大于MP、OMP，這與鄰苯二酚對BSA一級結構有更大影響相對應。蛋白質中的α-螺旋、β-折疊結構是靠氫鍵來穩定的，酚類化合物的加入造成蛋白分子內部的氫鍵發生改變，從而導致BSA二級結構的變化。RAWEL等[25]在探究綠原酸共價結合誘導牛血清白蛋白的結構變化時發現，綠原酸和BSA的反應導致BSA α-螺旋減少，而其余結構增加。JIANG等[43]在研究乳清蛋白分離物(whey protein isolates, WPI) 和酪蛋白(casein, CS) 與綠原酸非共價相互結合時，發現WPI、CS紅外光譜圖中酰胺I和酰胺II的移動，并且α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加。這些結果與本研究結果一致。

表2 基于FTIR的BSA及其復合物二級結構分析 單位：%

2.4.2 圓二色譜分析

圓二色譜是研究蛋白質構象的一種常用方法，在近紫外區，蛋白質的圓二色性主要由側鏈基團所貢獻，主要用來分析蛋白質二級結構的變化。酚類化合物與BSA結合前后的結構變化如圖4所示。BSA處于天然狀態時圓二色譜線在190 nm左右為正峰，205～235 nm時為負槽。在209和222 nm左右呈現出2個負槽，稱為雙負槽曲線，代表BSA的α-螺旋結構；在215 nm左右的負槽代表β-折疊結構。當BSA與酚類化合物反應后，CD峰強度發生改變，圖譜出現輕微的藍移現象，表明氧化與未氧化的OP、MP與BSA的反應改變了蛋白質的二級結構。

圖4 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA相互作用的近紫外圓二色譜圖Fig.4 Near-UV circular dichroism of interaction betweenOP, MP and BSA

采用Dichroweb程序對BSA及BSA復合物的二級結構的百分含量進行了估算，結果如表3所示，CD結果與紅外結果一致。與BSA相比，4種BSA復合物的α-螺旋含量降低，而其余結構增加。CD結果在數值上與FTIR的結果存在一些差異，這可能由于樣品不同所致，紅外光譜測定的樣品為凍干樣，而遠紫外CD色譜測定的樣品為水溶液。

表3 基于CD的BSA及其復合物二級結構分析 單位：%

2.5 鄰苯二酚、間苯三酚對BSA變性溫度的影響

DSC是測定蛋白質變性溫度的一種常用手段，進而反映出蛋白質構象的變化。MOSTAFA等[44]在研究咖啡酸和乳清蛋白相互作用時發現，綠原酸在堿性條件下修飾乳清蛋白會提高蛋白的熱穩定性。本文所研究的BSA變性溫度為86 ℃，如圖5所示，與酚類化合物反應后，OOP-BSA、OP-BSA、OMP-BSA、MP-BSA的Tmax分別為90、89、87、90 ℃，均有所升高。

圖5 BSA及其復合物的差式掃描圖Fig.5 Differential scan of BSA and its complexes

熱變性溫度與蛋白質的二級結構密切相關，蛋白質二級結構的β-折疊比α-螺旋的疏水性更強，因此β-折疊含量更高的蛋白質的熱變性溫度更高[37]。因此當鄰苯二酚、間苯三酚與蛋白質相互作用使β-折疊增加時，會導致變性溫度升高。根據FTIR分析結果，OMP-BSA 復合物β-折疊含量增加幅度最低，因此其變性溫度的變化幅度最小。并且OP、MP的引入使BSA無規則卷曲含量升高，說明BSA的有序相結構含量減少，無序結構增加，這也可能導致BSA變性溫度升高[44]。

3 結論

鄰苯二酚、間苯三酚與BSA既能發生共價相互作用也能發生非共價相互作用。共價相互作用是蛋白質氨基酸側鏈和醌之間的反應，非共價相互作用主要是氫鍵和疏水相互作用，導致BSA表面疏水性降低。這些反應使BSA的構象發生顯著變化，主要是二級結構改變 (α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉角和無規則卷曲含量増加)、熱變性溫度升高。這些結果對于進一步研究褐藻多酚與蛋白質相互作用的機理提供了依據。