β-胡蘿卜素模擬體系超聲降解機制研究

于奉生，孫志高，方明，馬亞琴，盛冉

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712) 2(魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂，276000)

類胡蘿卜素是對以類異戊二烯為基本單元構成的類萜化合物及其衍生物的總稱，柑橘汁中富含類胡蘿卜素，它們不僅對果汁感官品質影響極大，而且也是重要的功能性成分，具有清除自由基、抗癌、抗腫瘤、降血脂、預防骨質疏松癥及增強機體免疫力等多種生理功能[1]。由于人體自身不能合成類胡蘿卜素，食用水果和蔬菜是其主要來源，故富含類胡蘿卜素的柑橘汁受到研究者和消費者的廣泛關注[2]。

殺菌處理能有效殺滅有害微生物、鈍化酶活性和延長貨架期，是柑橘汁加工最為關鍵的環節之一。傳統巴氏殺菌雖能達到良好的殺菌效果，但對柑橘汁中類胡蘿卜素含量的影響較大。超聲殺菌作為一種新型非熱殺菌技術，既可達到殺菌效果，又能最大限度地保存果汁中的營養成分，因此逐漸受到廣泛關注和研究。相比于傳統的熱殺菌，超聲殺菌雖然能減少柑橘汁中類胡蘿卜素等熱敏性物質的損失，但類胡蘿卜素在超聲過程中，受超聲功率、超聲溫度等外源因子影響較大，此外，柑橘汁中的糖、酸、Vc等內源因子也會對其降解產生重要的影響[3-5]。

柑橘汁中的類胡蘿卜素存在于果汁的水相體系中，因此研究水相體系中類胡蘿卜素的降解能更好地反映出其在超聲過程中的降解規律及降解機制。本實驗選取β-胡蘿卜素代表類胡蘿卜素，構建β-胡蘿卜素水相模擬體系，考察超聲作用下南豐蜜桔汁模擬體系中糖、酸、Vc等內源因子對類胡蘿卜素的影響；建立降解動力學模型，探究β-胡蘿卜素在不同超聲功率、溫度、時間等外源因子下的降解規律，對其降解產物進行鑒定，從而了解各因子對類胡蘿卜素降解的具體影響，探究其在超聲過程中的降解規律及降解機制，對有效防止其在超聲殺菌過程中的損失具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素(純度≥96.0%)，上海源葉生物科技公司；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether, MTBE)、四氫呋喃(均為色譜純)，美國Sigma公司；丙酮、乙醚、KOH、NaOH(均為分析純)，重慶川東化工有限公司；2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene, BHT)、吐溫-80、檸檬酸、KBr(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠；抗壞血酸、葡萄糖、果糖、蔗糖(純度均≥99.0%)，北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DP-800超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司；LD-915恒溫槽，寧波天恒儀器廠；TTL-DCI氮吹儀，北京同泰聯科技發展有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Ultimate3000高效液相色譜儀，戴安中國有限公司；Shodex RI-101示差折光檢測器，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；Prestige-21傅里葉光譜掃描儀，日本島津公司；7890B/5977A氣相色譜-單四級桿質譜聯用儀、DB-5MS石英毛細管柱，美國Agilent公司；頂空固相微萃取操作臺、手動頂空固相微萃取進樣器，美國Supelco公司；L-550臺式低速大容量離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 β-胡蘿卜素水相體系的構建

參照王樹林[6]的方法，略有修改，具體如下：稱取5.0 mg β-胡蘿卜素用10.0 mL二氯甲烷溶解，然后用1.0 g吐溫-80乳化，避光條件下將二氯甲烷液氮吹干，用100 mL蒸餾水將其溶解成質量濃度為50 mg/L的β-胡蘿卜素水相儲備液。

1.3.2 南豐蜜桔汁中類胡蘿卜素、糖、酸、Vc的含量測定

1.3.2.1 類胡蘿卜素的測定

參照PUPIN等[7]和陶俊等[8]的方法，略有修改，具體如下：取10 mL柑橘汁，加入適量含1 g/L抗氧化劑BHT的丙酮提取，充分振蕩，使其充分混合，然后在4 000 r/min離心10 min，將沉淀再用含1 g/L BHT 的丙酮繼續提取2～3次，直至沉淀無色，將濾液在35 ℃下真空旋轉蒸發至干；用乙醚(含1 g/L BHT)復溶，加100 g/L KOH-甲醇溶液(含1 g/L BHT)，置于暗處皂化反應3 h，加入100 g/L NaCl 使之分層萃取，水相再用乙醚(含1 g/L BHT)二次萃取，合并乙醚相，用蒸餾水反復洗至中性，用無水Na2SO4干燥，過濾，濾液在35 ℃下真空旋轉蒸發至干，用V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1混合液定容至2 mL棕色瓶中，置于-18 ℃冰箱中備用，上樣前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

類胡蘿卜素的HPLC條件為：流動相：A為水, B為甲醇，C為MTBE。0 min 5%(體積分數，下同)A，90%B，5%C；12 min 95%B，5%C；25 min 89%B，11%C；40 min 75%B，25%C；60 min 50%B，50%C；62 min 5%A，90%B，5%C。色譜柱YMC C30(4.6 mm×250 mm，5μm)，檢測波長450 nm，柱溫為40 ℃, 進樣量20 μL，流速為1.0 mL/min，B和C均含有1 g/L BHT。

1.3.2.2 葡萄糖、果糖、蔗糖的測定

參照葛寶坤等[9]的方法，略有修改，采用高效液相色譜法，檢測器為示差折光檢測器。具體條件：流動相：85%乙腈，色譜柱：Phenomenex Luna NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為40 ℃，檢測池40 ℃，進樣量10 μL，流速為2 mL/min。

1.3.2.3 可滴定酸的測定

參照GB/T 8210—2011《柑桔鮮果檢驗方法》中的指示劑法測定[10]。準確吸取25 mL果汁樣品，蒸餾水稀釋至250 mL后搖勻。將10 mL稀釋后的果汁置于150 mL錐形瓶中，加入2～3滴10 g/L的酚酞，然后用已經標定的NaOH溶液滴定至微紅色且30 s不褪色。

1.3.2.4 Vc的測定

參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸》中的2，6—二氯靛酚滴定法[11]。

1.3.3 南豐蜜桔汁模擬體系的超聲處理

將配制好的11組南豐蜜桔汁模擬體系分別在超聲殺菌條件(超聲功率720 W、超聲溫度50 ℃、超聲時間36 min)下處理后，對各體系中β-胡蘿卜素的含量進行檢測，每組重復處理3次。

1.3.4 β-胡蘿卜素水相模擬體系降解動力學模型的構建

將配制好的β-胡蘿卜素水相模擬體系在不同超聲溫度(30、40、50、60、70 ℃，720 W)和不同超聲功率(180、360、540、720、900 W，50 ℃)下分別處理10、20、30、40、50、60 min，檢測β-胡蘿卜素的含量，每組重復處理3次，建立β-胡蘿卜素水相模擬體系在不同超聲溫度及不同超聲功率下的降解動力學模型。應用試錯法假設反應級數分別為零、一、二時，根據其相應的動力學模型反應物濃度(C)與時間(t)、反應物濃度的對數(lnC)與時間(t)、反應物濃度倒數(1/C)與時間(t)應該為線性關系，相關系數(R2)最高的模型即為其降解動力學模型。零級，一級，二級模型分別如公式(1)(2)(3)所示：

(1)

(2)

(3)

式中：C，反應物在給定時間的質量濃度,mg/L；C0，為反應物的初始質量濃度,mg/L；k，速率常數；t，超聲時間,min。

1.3.5 β-胡蘿卜素水相模擬體系降解產物的鑒定

1.3.5.1 異構體的鑒定

采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法(high performance liquid chromatography-diode array detection, HPLC-DAD)分析經超聲處理后的β-胡蘿卜素的異構產物，使用DAD掃描了250～550 nm范圍內的異構體的紫外可見光譜，根據光譜特征及色譜行為對其進行鑒定。具體液相條件：流動相A為V(乙腈)∶V(甲醇)=70∶30, B為MTBE；B的體積分數在20 min內由0%增加到80%；色譜柱YMC C30(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長460 nm，柱溫為40 ℃, 進樣量20 μL，流速為1.0 mL/min，A和B均含有0.1% BHT。

1.3.5.2 氧化產物的鑒定

經超聲處理的β-胡蘿卜素經KBr壓片法處理后，采用傅里葉紅外光譜掃描，分析其官能團的變化。

1.3.5.3 揮發性產物的鑒定

色譜條件：色譜柱DB-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2.5 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持10 min；進樣口溫度230 ℃，不分流進樣，載氣(He)流速1.5 mL/min。

質譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍m/z40～400。

1.3.6 數據處理

所有實驗測得的數據都以3個重復的“平均值±標準差”表示，采用Excel進行數據處理，Origin 9.0繪制實驗結果圖。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素水相體系的構建

β-胡蘿卜素水相體系的紫外光譜掃描曲線如圖1所示，發現其在水及四氫呋喃中的特征吸收曲線具有相同的特征吸收峰，且均在460 nm處有最大的吸光值，因此水相體系中β-胡蘿卜素的含量可直接用分光光度法來測定其吸光值，根據吸光值的大小來計算其濃度。

圖2是超聲過程中β-胡蘿卜素在水及四氫呋喃中的降解趨勢，其降解趨勢存在顯著差異，原因主要是超聲的空化效應與溶劑的表面張力、黏度及飽和蒸汽壓等物理特性有關，其中溶劑的飽和蒸汽壓對超聲空化效應影響最大,飽和蒸汽壓越高，空化效應越弱[12]。相比四氫呋喃，水的飽和蒸氣壓低，因此水相體系中的空化效應較強，更能反映類胡蘿卜素在柑橘汁中的存在狀態。

圖1 β-胡蘿卜素在水相體系和四氫呋喃中的典型吸收曲線Fig.1 Absorption profile of β-carotene in aqueoussolution and tetrahydrofuran

圖2 超聲過程中β-胡蘿卜素在水相體系和四氫呋喃中的降解趨勢Fig.2 Degradation trend of β-carotene in aqueoussolution and tetrahydrofuran during ultrasound treatment

2.2 內源因子的影響

2.2.1 南豐蜜桔汁模擬體系的構建

通過檢測得到南豐蜜桔汁中各物質的質量濃度：葡萄糖(glucose，G)19.3 g/L、果糖(fructose,F)20.2 g/L、蔗糖(sucrose,S)60.6 g/L、檸檬酸(citric acid，CA)5.9 g/L、Vc 141.9 mg/L。根據檢測結果，分別設計含有各單糖及總糖、酸、Vc的模擬體系，然后進行配制，11組模擬體系的具體構成見表1。

表1 模擬體系中β-胡蘿卜素、糖、酸、Vc的添加量Table 1 Fortified content of β-carotene,sugars,citricacid and Vc in various model systems

續表1

2.2.2 各內源因子對類胡蘿卜素降解的影響

配制好的11組南豐蜜桔汁模擬體系分別經超聲殺菌(超聲功率720 W、超聲溫度50 ℃、超聲時間36 min)處理后，其β-胡蘿卜素的含量如圖3所示，通過對各組β-胡蘿卜素含量的比較可以發現各內源因子及其協同作用對類胡蘿卜素降解的影響。

圖3 超聲處理后不同模擬體系β-胡蘿卜素含量Fig.3 Content of β-carotene in various modelsystems after ultrasound treatment

對照組1中β-胡蘿卜素降解了30.21%，在2組和7組分別添加Vc和檸檬酸，其降解率分別為36.46%和44.79%，說明二者均能促進類胡蘿卜素的降解，而8組損失了53.13%，證明二者共同存在對降解有增效作用。孫明奇等[13]研究了柑橘皮粉類胡蘿卜素提取液在不同條件下的穩定性，結果表明酸性條件下類胡蘿卜素的保存率較低，檸檬酸等酸味劑也有促降解的效果。此外，Vc能還原活性氧產生較多的羥基自由基，起到促氧化的作用，從而使類胡蘿卜素發生降解[4]。

4組、5組和6組中分別添加葡萄糖、蔗糖、果糖，其降解率分別為27.08%、21.88%、26.04%，添加了3種糖的3組降解率為14.58%，究其原因可能是糖通過降低體系中的水分活度及溶解氧，進而對類胡蘿卜素的降解有保護作用[5]。9組、10組分別為β-胡蘿卜素-糖-Vc和β-胡蘿卜素-糖-酸體系，降解率分別為25.00%和35.42%，說明糖能阻止Vc和酸對類胡蘿卜素的破壞，但在降解過程中，9組中主導的是糖對降解的保護作用，10組中主導的是酸對降解的促進作用。11組為添加了糖、酸、Vc的類胡蘿卜素模擬體系，該體系的降解率為39.58%，比9組和10組高，而比8組低，也能說明超聲處理過程中，酸和Vc能促進類胡蘿卜素降解，而糖對其有一定的保護作用。

2.3 降解動力學的建立

2.3.1 不同超聲溫度降解動力學的建立

依據試錯法得到不同超聲溫度下β-胡蘿卜素的降解動力學模型如圖4所示，其動力學方程及決定系數見表2，30 ℃時β-胡蘿卜素的降解符合零級動力學模型，40～70 ℃時符合一級動力學模型，如表2所示。

圖4 不同超聲溫度下β-胡蘿卜素降解動力學曲線Fig.4 Degradation kinetics curve of β-caroteneunder different ultrasound temperatures

表2 不同超聲溫度下β-胡蘿卜素降解反應級數、動力學方程、反應系數、決定系數和半衰期Table 2 Degradation reaction order，kinetic equations，k，R2 and t1/2 of β-carotene under differentultrasound temperatures

溫度/℃反應級數線性方程k/(min-1)(P<0.05)R2(P<0.05)t1/2/min300y=-0.042 5x+0.203 60.042 50.910 6122.438401y=-0.00 6x-0.040 50.006 00.925 0108.775501y=-0.00 9x-0.049 90.009 00.958 871.472601y=-0.014x-0.021 70.001 40.947 547.961701y=-0.024 9x-0.021 40.024 90.975 526.978

注：40、50、60、70 ℃在主坐標軸，30 ℃在次坐標軸

基于動力學模型計算出不同超聲溫度下的反應系數及半衰期，從而可以看出隨著溫度的升高降解率也隨著上升。孫玉敬[14]研究-5～35 ℃下超聲處理全反式β-胡蘿卜素的二氯甲烷溶液，結果隨著溫度的升高降解率下降，與本實驗結果存在差異。可能的原因是在-5～35 ℃的低溫下，超聲的空化效應在降解的過程中起主導作用，二氯甲烷的飽和蒸汽壓隨著溫度的升高而升高，從而空化效應減弱，使得β-胡蘿卜素的降解率也隨之降低。本實驗的溫度較高且是在水相體系中進行的，熱效應是在降解過程中起主導作用，因此降解率會隨溫度升高而上升。

處理條件不同，類胡蘿卜素的降解動力學模型也會有所差異。SUN等[15]發現β-胡蘿卜素的降解在低溫下符合一級動力學模型，在25 ℃符合二級動力學模型。此外，熱處理條件下β-胡蘿卜素的降解符合零級動力學模型，而在光處理下又符合一級動力學模型[16]。

2.3.2 不同超聲功率降解動力學的建立

不同超聲功率下β-胡蘿卜素的降解動力學模型如圖5所示，其動力學方程及決定系數見表3。

圖5 不同超聲功率下β-胡蘿卜素降解動力學曲線Fig.5 Degradation kinetics curve of β-caroteneunder different ultrasound power

表3 不同超聲功率下β-胡蘿卜素降解反應級數、動力學方程、反應系數、決定系數、半衰期Table 3 Degradation reaction order，kinetic equations，k，R2 and t1/2 of β-carotene under differentultrasound power

超聲功率/W反應級數線性方程k/(min-1)(P<0.05)R2(P<0.05)t1/2/min1801y=-0.005 7x-0.049 40.005 70.892 2112.9383601y=-0.008 3x-0.036 40.008 30.914 279.1265401y=-0.013x-0.078 50.0130.926 747.2817201y=-0.009x-0.049 90.0090.958 871.4729001y=-0.010 6x-0.050 60.010 60.915 660.618

180～900 W時β-胡蘿卜素的降解均符合一級動力學模型。不同超聲功率下的反應系數及半衰期如表3所示，在本實驗的功率范圍內，降解率先升高后降低然后接近平衡，540 W時降解率最大。可能的原因是在180～540 W范圍內，超聲空化效應隨超聲功率的提高而增強，當功率超過540 W時產生的空化氣泡過大來不及破裂，即使破裂產生的爆破強度也不高，同時過多地空化氣泡會引起超聲波的散射，阻礙超聲波的傳播，導致降解率下降。而當功率超過720 W時，導致降解率不再降低的原因可能是，較高的超聲功率產生的熱量無法在短時間內得到釋放，這些熱量也可能引發類胡蘿卜素的降解。

本實驗是在超聲活性區域建立的β-胡蘿卜素的降解動力學模型，該區域具有較強的超聲空化效應，同時存在動態變化以及不均一性的超聲化學效應，此外它們與熱效應相互疊加，使得不穩定的類胡蘿卜素的降解動力學模型較為復雜。

2.4 異構體的鑒定

2.4.1 異構體的定性鑒定

經過不同條件超聲處理的β-胡蘿卜素會產生不同的異構體，采用HPLC-DAD對其進行分離及鑒定，圖6-B為超聲功率720 W，超聲溫度 50 ℃下產生的3種異構體，即峰1、2、4。

A-β-胡蘿卜素標準品;B-超聲處理后的β-胡蘿卜素圖6 β-胡蘿卜素高效液相色譜圖Fig.6 HPLC figure of β-carotenes

圖7即為峰1、2、4對應的紫外可見光譜。全反式β-胡蘿卜素僅在460 nm左右有一個“三指形”吸收峰，而其順式異構體除了主要吸收峰之外，還在330～340 nm處出現一個吸收峰，即“順式峰”，此順式峰吸光度和主吸收峰吸光度的比值，即為Q值。根據此Q值和相關文獻報道來對異構體進行判斷，經判斷峰1、2、4分別為15-順式、13-順式和9-順式β-胡蘿卜素，具體見表4。

圖7 超聲處理后β-胡蘿卜素及其異構體的光譜特征圖Fig.7 Spectral overlays of β-carotene and its isomersafter ultrasound treatment注：1、2、4在主坐標軸，3在次坐標軸

2.4.2 異構體的定量鑒定

因全反式構型的熱力學更為穩定，因此類胡蘿卜素主要以全反式的形式存在，順反異構體在許多物化性質上存在差異，比如順式異構體顏色的明亮度或飽和度較低，熔點較低，吸光系數較小以及熱力學不穩定等。不同超聲條件下生成的異構體含量如圖8所示，圖8-A顯示不同超聲溫度下，3種異構體的含量先隨溫度上升而升高，50 ℃之后溫度過高，在超聲及熱效應的共同作用下，導致生成的異構體降解，因此異構體的含量隨溫度升高而下降。圖8-B顯示不同超聲功率下，3種異構體的含量隨功率上升而升高，720 W之后功率過高，導致異構體的含量不再升高甚至下降。

表4 β-胡蘿卜素異構體的鑒定Table 4 Identification of β-carotene isomers

注：a以正己烷為流動相；b梯度洗脫，V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=84∶14∶2和二氯甲烷(體積比從 80∶20 到 45∶55)；c梯度洗脫，V(甲醇)∶V(異丙醇)=99∶1和二氯甲烷(體積比從100∶0到70∶30)；d梯度洗脫，V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=84∶14∶2和二氯甲烷(體積比從100∶0到45∶55)[17-20]

A-不同超聲溫度;B-不同超聲功率圖8 不同超聲條件下β-胡蘿卜素異構體含量Fig.8 The contents of β-carotene isomers under differentultrasound conditions注：13-順式、9-順式在主坐標軸，15-順式在次坐標軸

2.5 氧化產物的鑒定

圖9 β-胡蘿卜素紅外光譜圖Fig.9 FTIR spectra of β-carotene

2.6 揮發性產物的鑒定

超聲處理后β-胡蘿卜素降解產生的揮發性產物采用GC-MS進行分析，其總離子流圖見圖10，這些揮發性產物的詳細介紹如表5所示，其中β-紫羅蘭酮相對含量最高(27.73%)，其次是異佛爾酮(15.15%)、2,2,6-三甲基環己酮 (8.31%)、3-己醇(6.18%)、β-環檸檬醛(5.92%)；此外還有3,5,5-三甲基-2-環己烯-1-醇(2.41%)等降異戊二烯化合物。這些揮發性物質不僅具有特殊的香氣，影響柑橘汁的風味，還具有多種生物活性功能，比如β-紫羅蘭酮不僅能降低血脂，還能抑制癌細胞、調控體內癌細胞增殖[22]。

圖10 β-胡蘿卜素降解產物的GC-MS總離子流圖Fig.10 Total ion current chromatograms of volatilecompounds of β-carotene degradation

表5 β-胡蘿卜素水相體系中的揮發性成分Table 5 Volatile compounds of β-carotene in pure aqueous

續表5

序號保留時間/min化合物分子式相對含量/%1929.61萘 naphthaleneC10H81.062029.88β-紫羅蘭酮 beta-iononeC13H20O27.732130.065,6-環氧-β-紫羅蘭酮 5,6-epoxy-beta-iononeC12H20O20.912232.024-(2,2,6-三甲基-7-氧雜二環[4,1,0]庚-1-基)-3-丁烯-2-酮4-(2,2,6-trimethyl-7-oxabic yclo[4.1.0]hept-1-yl)-3-buten-2-oneC13H20O21.632337.11十六烷 hexadecaneC16H341.32

3 結論

(1)選用β-胡蘿卜素代表類胡蘿卜素，構建其水相模擬體系。通過測定南豐蜜桔果汁中糖、酸、Vc含量，配制11組模擬體系來探究各內源因子及其協同作用對類胡蘿卜素降解的影響。超聲處理過程中，Vc和檸檬酸均能促進類胡蘿卜素降解，且二者共存時具有增效作用；糖對類胡蘿卜素有一定的保護作用，能不同程度地阻止Vc和酸對類胡蘿卜素的破壞。

(2)分別建立不同超聲溫度和超聲功率下β-胡蘿卜素的降解動力學，發現只有30 ℃時符合零級動力學模型，其余條件下均符合一級動力學模型，但其降解規律及降解機制存在差異。不同超聲溫度下，降解率隨著溫度的升高而上升，主要是熱效應所致；不同超聲功率下，降解率是先升高后降低，然后接近平衡，540 W時降解率最大，主要是超聲空化效應所致。