燕麥β-葡聚糖及其寡糖對腸道菌群結構和代謝的影響

王如月，余訊，徐靜靜，朱莉，詹曉北*，張洪濤

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(南京醫科大學附屬無錫第二醫院，江蘇 無錫，214002) 3(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

人類腸道中有數萬億個微生物，已發現有超過1 500個不同的種類[1]，這些腸道微生物群構成了一個復雜的群體，它們對于宿主的免疫和代謝至關重要，與人類的健康和疾病息息相關[2-3]。膳食是影響人體腸道菌群微生態最重要的因素之一，腸道微生物本身及其代謝產物不僅能夠調節人體代謝，更能在膳食和宿主之間起到重要的橋梁作用[4-5]。ZHAO等[6]發現，膳食纖維可以選擇性地促進腸道中產短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)菌的生長，從而增加短鏈脂肪酸產量，進而減輕2型糖尿病的癥狀。MIYAMOTO等[7]通過將無菌小鼠與普通小鼠進行對比實驗，發現大麥β -葡聚糖的有益代謝作用，是通過腸道微生物群產生的SCFAs促進腸激素分泌誘導而起作用的。

燕麥是一種全價營養谷物，近年來，隨著人們對健康的關注，燕麥因其高膳食纖維含量成為研究熱點。β -葡聚糖天然存在于燕麥的細胞壁中，被認為是具有潛在益生元特性的功能物質[8]。燕麥β -葡聚糖作為常見的膳食纖維具有降低膽固醇和餐后血糖反應等功效，這在針對動物[9]以及人類[10]的許多研究中都得到了證實。β-葡聚糖的水解產物β-葡寡糖，作為一種不可消化的低聚糖，也被證實具有促進乳酸菌生長[11]和免疫調節[12]等的作用。

燕麥β-葡聚糖(oat β-glucans, OGs)及其寡糖(oat β-glucans oligosaccharides, OGOs)不可以被人體自身消化吸收，但可以進入結腸被腸道菌群利用，能夠作為益生元影響腸道微生物的組成以及其代謝產物的變化。近年來，國內外對β-葡聚糖益生功能的研究日趨增多，SHEN等[13]報道了燕麥β-葡聚糖可以促進小鼠腸道菌群雙歧桿菌和乳酸菌生長，并減少大腸桿菌數量。LAM等[8]對不同分子質量的β-葡聚糖進行了益生元效果評價，發現分子質量為28 000 Da的β-葡聚糖的益生元效果最佳。但是目前國內外對低聚糖類益生元的研究主要集中在低聚果糖、低聚半乳糖等，關于植物來源的β-葡寡糖對腸道菌群改善作用的研究較少，有關腸道菌群對β-葡聚糖和其水解產物β-葡寡糖的發酵特性差異的研究更是鮮有報道。

本研究通過以OGs及其水解產物OGOs為碳源，對健康人和2型糖尿病人來源的糞便菌群進行體外厭氧發酵，研究OGs和OGOs對不同來源腸道菌群結構和代謝物的影響，初步探索腸道菌群對OGs及其水解產物OGOs的發酵特性差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要實驗材料

燕麥(AvenasativaL.)麩皮，河北省張家口市萬全縣；菊粉，比利時cosucra公司；耐高溫α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、刃天青，麥克林生化科技有限公司；維生素K1、L-半胱氨酸鹽酸鹽、膽汁鹽，Sigma-Aldrich公司；TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；熒光定量試劑Fast SYBR Green Master Mix，美國應用生物系統公司；其他試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設備

多角度激光光散射凝膠色譜系統(DAWN HELEOS Ⅱ)，美國懷雅特技術公司；MALDI-TOF/TOF基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜儀，美國布魯克·道爾頓公司；厭氧培養箱(HYQX-Ⅱ)，上海躍進醫療器械有限公司；氣相色譜儀(7890A)，安捷倫科技有限公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司。

1.2 OGs和OGOs的制備

1.2.1 OGs的提取純化方法

β-葡聚糖提取采用熱水浸提法，參考PAPAGEORGIOU等[14]的方法，略有改動。提取流程見圖1。利用MCCLEAR等[15]的方法測定β-葡聚糖的純度，不同批次制得的OGs純度范圍在85.7%～93%。

圖1 OGs的提取流程圖Fig.1 The extraction flow chart of OGs

1.2.2 OGOs的制備方法

OGOs由OGs酸解制得，準備10 g/L的OGs溶液，80 ℃水浴預熱，加入等體積的H2SO4溶液(2 mol/L)。在80 ℃水浴振蕩下酸解3.5 h，使用Ba(OH)2中和樣品，過濾除去BaSO4沉淀,并用去離子水洗滌沉淀。將水解液體積濃縮至1/5，用3倍體積乙醇醇沉除去大分子多糖，10倍體積乙醇醇沉，將寡糖醇沉下來，取沉淀，復溶于水，透析48 h除鹽(透析袋截留分子質量為100～500 Da)，冷凍干燥得OGOs。

1.2.3 OGs和OGOs的分子質量測定

OGs的分子質量測定采用凝膠滲透色譜和十八角度激光散射聯用技術測定，采用分子篩柱SHODEX SB-804-HQ，柱溫30 ℃，流動相100 mmol/L NaNO3，流速0.5 mL/min。利用基質輔助激光電離飛行時間質譜分析OGOs的聚合度分布，質譜掃描范圍(m/z)100～3 000。

1.3 體外發酵方法

1.3.1 糞便樣品的收集

新鮮的糞便樣品取自無錫市當地醫院和大學，共5位2型糖尿病患者和5位健康志愿者，其中5位健康志愿者，3男2女，年齡47～63歲，身體質量指數(body mass index, BMI)為(26.60±1.64) kg/m2，空腹血糖為(4.92±1.02) mmol/L。5位2型糖尿病患者，4男1女，年齡45～64歲，BMI為(24.82±1.87) kg/m2，空腹血糖為(8.97±2.15) mmol/L。所有的志愿者均遵循正常中國飲食，沒有消化系統疾病，且至少3個月沒有服用抗生素。糞便樣品用專用的糞便收集盒收集后，低溫保存運輸。將收集到的新鮮糞便樣品，分為健康組和2型糖尿病組，每組糞便樣品等質量混合后，用無菌PBS緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)按照100 g/L稀釋樣品，渦旋均質，用無菌紗布(4層)過濾掉雜質，得到的糞便勻漿用于接種。此研究方案已由無錫市第二人民醫院倫理委員會審批通過，并且從每位參與研究的志愿者處獲得了書面知情同意書。

1.3.2 OGs和OGOs的體外發酵

體外發酵糞便微生物的方法參考YANG等[16]的方法，略有修改。以添加OGs/OGOs為碳源的培養基，體外發酵健康人和2型糖尿病人糞便微生物。以菊粉為陽性對照組、無碳源為空白對照組。體外發酵是在厭氧管中進行的，工作體積為5.5 mL。碳源的添加量為5.0 g/L，基礎培養基(1 L)包括：2 g胰蛋白胨，2 g酵母提取物，0.1 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaCl2·6H2O，2 g NaHCO3、2 mL吐溫80、0.025 g氯化血紅素，0.002 g維生素K1、0.5 gL-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g膽汁鹽和4 mL刃天青溶液(0.25 g/L)，pH 6.8～7.0。每個厭氧管中注入添加相應碳源后的基礎培養基5 mL，滅菌。將準備好的糞漿接種液按10%的接種量分別接入到培養基中，在37 ℃厭氧環境下培養。在發酵0和48 h，取出樣品測定pH、總糖含量、產氣量、SCFA含量等。其中pH用pH計直接測定，總糖含量采用苯酚硫酸法[17]測定。以上所有實驗，均1式3份進行。

1.4 產氣量的測定

參考RYCROFT等[18]的方法。將裝有無菌針的活塞注射器插入到每個培養瓶的橡膠塞中，在發酵過程中，伴隨著產氣體積的增加，培養瓶的頂部壓力增加，推動注射器活塞上移，進而達到測產氣量的目的。

1.5 SCFAs含量的測定

將每個待測樣品的發酵液取出1 mL，以13 000 r/min離心3 min，并將上清液貯存在-20 ℃，備用。將上清液(1 mL)中加入10 μL內標(100 mmol/L 2-乙基丁酸)和250 μL HCl溶液，用1 mL無水乙醚萃取目標產物，分離出有機相，加入無水Na2SO4除水，過0.22 μm有機系濾膜。使用配備有氫火焰檢測器(flame ionization detector,FID)的氣相色譜儀定量測量樣品，載氣為N2，分流比20∶1，流速為1.5 mL/min，采用熔融石英毛細管色譜柱(Agilent，HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm)。溫度程序如下：以20 ℃/min從60 ℃升溫到190 ℃，維持4 min。檢測器溫度250 ℃，進樣口溫度220 ℃，進樣量為5 μL。使用集成的安捷倫數據庫記錄和處理數據。乙酸、丙酸和丁酸濃度根據相同條件下測定的標準曲線確定。

1.6 實時熒光定量PCR方法

1.6.1 DNA的提取

分別提取健康組和糖尿病組接種液的基因組DNA，以及每份發酵樣品發酵48 h后的基因組DNA。采用TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒，根據生產商的操作步驟提取DNA，將提取的基因組DNA貯存在-20 ℃,備用。

1.6.2 實時熒光定量PCR條件

每份發酵樣品的每個擴增反應均1式3份進行。反應體系10 μL：Fast SYBR Green Master Mix 5 μL，20 μmol/L上下游引物各0.2 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 4.1 μL。反應條件：先在95 ℃下進行120 s的預變性，然后95 ℃進行3 s、60 ℃退火延伸30 s，共40個循環。最后進行溶解曲線分析，判斷擴增子特異性。在95 ℃下進行15 s，60 ℃下保持1 min后以0.3 ℃逐漸加熱，直到95 ℃，在此溫度下保持15 s。由系統軟件StepOne Software v2.3自動分析CT值。表1列出了使用的16S rRNA靶向引物。

表1 本實驗使用的16S rRNA靶向引物Table 1 16S rRNA gene primers used in this study

1.6.3 實時熒光定量PCR數據處理

參考VIGSNAES等[19]的相對定量方法。靶向引物編碼的16S rRNA序列對應的目標菌的相對含量，由E-ΔCT計算得到。其中ΔCT是相應細菌的CT值減去總細菌的CT值；E是引物效率，E=10-1/s,s是該引物對應標準曲線的斜率。標準曲線測定方法：將其中1個發酵樣品的基因組DNA稀釋10n倍，用同樣方法進行實時熒光定量PCR,以CT-lg(1/10n)作圖。

1.7 數據處理

以上所述實驗均獨立重復3次，采用SPSS 22軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)分析方差，采用Tukey HSD法進行多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 OGs和OGOs的分子質量

OGs和OGOs分別通過熱水浸提法和OGs酸解制得。圖2為OGs的多角度激光散射凝膠色譜譜圖，采用系統軟件ASTRA 5.3.4分析，表明OGs的分子質量為1.34×105Da。OGOs的MALDI-TOF質譜譜圖如圖3所示，分析可知OGOs是由聚合度為3～11的β-葡寡糖組成。

圖2 OGs多角度激光散射凝膠色譜譜圖Fig.2 Multi-angle laser scattering gel chromatogram of OGs

圖3 OGOs的MALDI-TOF質譜譜圖Fig.3 MALDI-TOF mass spectrum of OGOs

2.2 總糖含量變化

分別以OGs、OGOs和菊粉為培養基碳源，對健康人和2型糖尿病人來源的糞便菌群進行體外厭氧發酵。通過測定0和48 h各組發酵液中的總糖含量(表2)，計算出健康人和2型糖尿病人糞便菌群發酵48 h后對不同碳源的利用情況。發酵48 h后，OGs的利用率在健康組和糖尿病組分別為96.29%和95.07%，OGOs的利用率在健康組和糖尿病組分別為93.92%和94.66%，菊粉在2組的利用率分別為92.89%和93.05%?？梢钥闯?，健康組和2型糖尿病組的腸道菌群都可以較好地利用OGs、OGOs和菊粉。

表2 健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發酵0和48 h后發酵液的總糖含量Table 2 Total carbohydrate content in fermented brothof healthy and type 2 diabetics after fecal flora fermentationwith different carbon sources for 0 and 48 h

2.3 pH和產氣量

通過測定0和48 h各組發酵液的pH(表3)，可以發現，在無碳源添加(空白)的情況下，各組發酵液的pH略微下降；以OGs、OGOs和菊粉為碳源進行糞菌發酵，各組發酵液的pH均明顯降低，其中健康組以OGs和菊粉為碳源的發酵液pH明顯低于OGOs組；2型糖尿病組以OGs為碳源的發酵液pH明顯低于OGOs組和菊粉組。以上結果說明，OGs和OGOs可能對結腸環境pH的降低有作用，結腸pH降低可以抑制病原菌，改善結腸環境[22]。

表3 健康人和糖尿病人糞便菌群以不同碳源發酵0和48 h后發酵液的pHTable 3 pH value of fermented broth of healthyand type 2 diabetics after fecal flora fermentation withdifferent carbon sources for 0 and 48 h

健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發酵48 h后，對各發酵體系的產氣量進行測定，結果如圖4所示，健康人的糞便菌群在分別利用3種不同碳源后，在產氣量上沒有顯著差異。但是2型糖尿病人的糞便菌群在分別利用3種不同碳源發酵后，在產氣量方面有較大差異：OGs組發酵體系的產氣量顯著低于菊粉組(P<0.05)；另外，OGOs組的產氣量也明顯低于菊粉組(P=0.087)；而OGs組與OGOs組的產氣量則無明顯差異。說明相比于菊粉，2型糖尿病人糞便菌群以OGs和OGOs為碳源發酵會產生較少氣體，這與文獻[23]報道的以葡聚糖或葡寡糖為碳源發酵糞菌比菊粉產氣量少的研究結果相一致。

圖4 健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發酵48 h后的產氣量Fig.4 Gas production of healthy and type 2 diabeticsafter fecal flora fermentation with different carbon sourcesfor 48 h注：同一組中標注的不同字母表示顯著差異(P<0.05)(下同)

2.4 SCFAs含量變化

腸道微生物發酵碳水化合物的主要代謝產物是SCFAs，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs在調節宿主代謝、降低結腸pH、免疫系統調節和細胞增殖方面具有關鍵作用[24]。采用氣相色譜法定量測定了健康人和2型糖尿病人糞便菌群以不同碳源發酵48 h后的發酵液中乙酸、丙酸以及丁酸的濃度，結果如圖5所示。從圖5-a和圖5-b可以看出，相比于空白組，以OGs、OGOs和菊粉為碳源發酵糞菌，健康人和2型糖尿病人糞便菌群發酵液中乙酸和丙酸濃度均顯著增加。由圖5-a不難看出，以OGs和OGOs為碳源發酵48 h后，健康人糞菌發酵液中OGs組和OGOs組乙酸濃度無顯著差異，而2型糖尿病人糞菌發酵液中，OGOs組乙酸濃度顯著高于OGs組。同樣，由圖5-b可以發現，經過48 h發酵后，2型糖尿病人糞菌發酵液中，OGOs組丙酸濃度顯著高于OGs組。圖5-c表明，與OGOs和菊粉相比，以OGs為碳源時，健康組和2型糖尿病組糞便菌群發酵48 h后發酵液中丁酸濃度均顯著增加。綜合以上結果，OGs和OGOs對腸道菌群代謝產SCFAs均有顯著的促進作用，其中，以OGs為碳源，可以顯著促進健康人和2型糖尿病人腸道菌群產丁酸；與OGs相比，以OGOs為碳源則可以顯著促進2型糖尿病人腸道菌群產乙酸和丙酸。

2.5 菌群組成變化

采用實時熒光定量PCR方法，測定了健康人和2型糖尿病人初始糞便菌群(0 h)和以不同碳源發酵糞菌48 h后發酵液中Firmicutes phylum、Bacteroidetes phylum、Lactobacillusspp.、Bifidobacteriumspp.以及主要產丁酸菌屬Clostridiumleptumsubgroup(C.leptumsubgroup)相對于總細菌的含量，結果如圖6和圖7所示。

圖5 健康人和2型糖尿病人糞便菌群利用不同碳源發酵48 h后發酵液中SCFAs含量Fig.5 SCFAs content in fermented broth of healthy and type 2 diabetics after fecal flora fermentationwith different carbon sources for 48 h

圖6 健康人和2型糖尿病人糞便菌群中各細菌相對總細菌的含量Fig.6 Relative quantities of target bacteria to totalbacteria in feces of healthy and type 2 diabetics注：各細菌相對總細菌的含量，由E-ΔCT計算得到。其中ΔCT是相應細菌的CT值減去總細菌的CT值；E是引物效率，E=10-1/s, s是該引物對應標準曲線的斜率。總細菌的相對含量為100%

從圖6中可以看出，與健康人相比，2型糖尿病人糞便菌群中厚壁菌門減少，擬桿菌門增多，乳酸桿菌和雙歧桿菌減少，但是差異均不顯著。但2型糖尿病人腸道菌群中產丁酸菌C.leptumsubgroup與健康人相比，相對含量顯著降低，健康組為35.05%，2型糖尿病組僅為2.42%。由此結果得出，相比于健康人，2型糖尿病患者糞便菌群中厚壁菌門/擬桿菌門比值(F/B值)下降，乳酸桿菌、雙岐桿菌含量減少，產丁酸菌含量顯著降低。以上結果與QIN等[25]關于2型糖尿病人產丁酸菌含量顯著下降的研究結果一致。FURET等[26]的研究結果也表明，2型糖尿病患者糞便菌群中F/B值下降，這是腸道菌群失調的重要標志之一[3]。以上結果表明，本研究中涉及到的2型糖尿病人的腸道菌群呈現中度失調。

從圖7可以看出，經過48 h發酵后，健康組和2型糖尿病組的乳酸桿菌和雙歧桿菌的相對含量均(比0 h時)顯著提高，其中健康組以菊粉和OGOs為碳源效果最佳，2型糖尿病組以OGOs為碳源提高作用最為顯著。以OGs和OGOs為碳源，健康人和2型糖尿病人糞便菌群中產丁酸菌C.leptumsubgroup相對總細菌的含量均顯著提高，其中，OGs組對產丁酸菌相對含量的提高作用顯著高于OGOs組。綜合以上結果，OGs和OGOs對健康人和2型糖尿病人糞便菌群組成有不同的調控作用：OGs對糞便菌群產丁酸菌豐度提高作用顯著，這一結果與OGs可以顯著提高糞便菌群發酵液中丁酸含量相對應；OGOs對糞便菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌的促生長作用較好。

a-健康組；b-2型糖病組圖7 健康人和2型糖尿病人糞便菌群利用不同碳源發酵0和48 h后各細菌相對總細菌的含量Fig.7 Relative quantities of target bacteria to totalbacteria in feces of healthy and type 2 diabetics fermentedwith different carbon sources for 0 and 48 h注：“OGs”、“OGOs”、“菊粉”、“空白”為以對應的碳源發酵48 h后各細菌相對總細菌的含量；“0 h”為糞便菌群發酵0 h，即健康人和2型糖尿病人原始腸道菌群中各細菌相對總細菌的含量

3 結論

本研究通過以OGs及其水解產物OGOs為碳源，對菌群結構相對平衡的健康人糞便菌群和菌群中度失調的2型糖尿病人糞便菌群進行體外發酵，探究了OGs及OGOs對健康人和2型糖尿病人腸道菌群結構及其代謝產物的影響。通過檢測體外發酵48 h后的發酵液pH、發酵體系產氣量、SCFAs含量和菌群組成變化，發現OGs和OGOs均可以明顯改善健康人和2型糖尿病人的腸道菌群結構，并對腸道菌群代謝產物SCFAs的產生有明顯的促進作用。由于OGs和OGOs在結構上存在聚合度和分支率的差異，它們在腸道菌群中可能有不同的酵解途徑，進而對腸道菌群的結構和代謝產物產生不同的影響：與OGOs相比，OGs可以顯著提高腸道菌群中產丁酸菌C.leptumsubgroup相對總細菌的含量，進而提高發酵液中丁酸的濃度；OGOs則較好地增加了腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌相對含量，并提高了發酵液中乙酸和丙酸的濃度。研究還發現,OGs和OGOs對腸道菌群的改善效果隨菌群來源不同而有所差別：OGs對產丁酸菌豐度的提高作用在健康人腸道菌群中較為顯著；OGOs對乳酸桿菌和雙歧桿菌的促生長作用以及對腸道菌群產乙酸和丙酸的促進作用，在2型糖尿病人腸道菌群中較顯著。綜合以上結論，OGs和OGOs對腸道菌群的組成和代謝有不同的改善作用，這種改善作用隨腸道菌群來源不同而有所差別，OGs和OGOs可能可以有針對性地改善2型糖尿病人腸道菌群的結構和相關代謝。