棒曲霉素對(duì)人胃黏膜細(xì)胞體外毒性機(jī)理研究

徐慧，賈麗娜，蘇婧一，徐俐俐，左樹娜，張偉,，楊倩*

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理工系，河北 滄州，061100) 2(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定，071000)

近年來，食品安全問題越來越受人們重視，食品中真菌毒素污染問題備受關(guān)注[1]。棒曲霉素(patulin，PAT)是一種主要由曲霉屬和青霉屬霉菌等真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，在水果及其制品、谷物及其制品、奶酪等均被檢測(cè)到[2-4]。已有研究表明攝入PAT會(huì)誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、刺激腸胃引發(fā)紊亂腫脹、導(dǎo)致肝腎病變等中毒癥狀[5]，嚴(yán)重危害人體健康。PAT被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)歸為第3類可疑致癌物質(zhì)[6]。雖然美國食品藥品監(jiān)督管理局、世界衛(wèi)生組織、歐盟、日本等已經(jīng)制定PAT限量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]，但PAT含量超標(biāo)對(duì)于食品安全和人類健康仍然有一定危險(xiǎn)。

目前針對(duì)食品中PAT的檢測(cè)技術(shù)及吸附解毒研究較多[7-8]，且應(yīng)用相對(duì)成熟，但對(duì)于PAT的毒理研究不足。國內(nèi)外諸多研究學(xué)者利用動(dòng)物或細(xì)胞模型從生殖毒性[9]、肝毒性[10]、腎毒性[11]以及腸毒性[12]等多個(gè)角度進(jìn)行了PAT毒性的研究。但關(guān)于PAT對(duì)人胃細(xì)胞體外毒性的研究未見報(bào)道。本文擬以人胃黏膜細(xì)胞(gastric epithelial cells，GES-1)為研究對(duì)象，探究PAT對(duì)其體外毒性作用機(jī)理，對(duì)于完善PAT的毒性機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人胃黏膜細(xì)胞(GES-1)，上海酶研生物科技有限公司；棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；胰蛋白酶，Solarbio公司；4%多聚甲醛固定液、4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI)染色液、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶檢測(cè)試劑盒、GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

CP-50A型CO2培養(yǎng)箱，湖南湘儀科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；680型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；OPTIMAL-100XP型超速離心機(jī)，美國Beckman公司；MRX-152型冷凍高速離心機(jī)，日本TOMY公司；EVOS F1型倒置熒光顯微鏡，美國LIFE公司；ABI PRISM 7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將GES-1細(xì)胞接種于含有DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清)的培養(yǎng)瓶中，在體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃、95%飽和大氣濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用2.5 g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，每隔3 d傳代1次，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

取1.2.1中生長良好的GES-1細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化處理，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)至融合狀態(tài)。依次設(shè)置對(duì)照組(不含PAT)，1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L PAT組(實(shí)驗(yàn)組)和空白組，37 ℃培養(yǎng)24 h。然后按照MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，在570 nm處測(cè)定各個(gè)反應(yīng)孔的吸光值，參照公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

實(shí)驗(yàn)過程中，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次進(jìn)行。

(1)

式中：A實(shí)驗(yàn)組,PAT處理組測(cè)得的吸光度;A對(duì)照組,不加PAT所測(cè)得的吸光度;A空白組,不加細(xì)胞只含DMEM培養(yǎng)基的吸光度。

1.2.3 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察

取1.2.1中生長良好的GES-1細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化處理，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置入已處理好的玻片，以104個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至融合狀態(tài)，棄去培養(yǎng)基。分別加入終濃度為0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L的PAT，24 h后取出細(xì)胞爬片，在室溫下用4%多聚甲醛固定液處理15 min。干燥后與10 μL DAPI(1.0 mg/L)染色液混合，室溫下染色3 min，棄DAPI染色液，然后用PBS洗滌5 min后，重復(fù)洗滌1次，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)Bax和Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

用終濃度0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L的PAT作用于生長良好的GES-1細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，并用RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取總RNA(詳細(xì)操作見試劑盒說明書)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)０濉＿M(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，內(nèi)參為β-actin。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。用2-ΔΔCt計(jì)算所得數(shù)據(jù)，得到Bax、Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞樣品準(zhǔn)備

取1.2.1中生長良好的GES-1細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化處理，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液更換為分別含有0、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L PAT的培養(yǎng)液，放入體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.6 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性的影響

取1.2.5中細(xì)胞樣品，按照總SOD檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)反應(yīng)孔在560 nm處吸光值。

1.2.7 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞過氧化氫酶(catalase, CAT)活力的影響

取1.2.5中細(xì)胞樣品，按照CAT檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)反應(yīng)孔在520 nm處吸光值。

取1.2.5中細(xì)胞樣品，按照GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)反應(yīng)孔在412 nm處吸光值。

1.2.9 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量的影響

取1.2.5中細(xì)胞樣品，按照MDA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)反應(yīng)孔在553 nm處吸光值。

1.2.10 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)量的影響

參照SINGH等[13]的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析

記錄1.2.6～1.2.9中檢測(cè)值，并按照各說明書計(jì)算各檢測(cè)指標(biāo)含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各指標(biāo)均為3組平行，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。采用SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3組數(shù)據(jù)間采用“One-way ANOVA”的Duncan’s法進(jìn)行比較分析，P<0.05為差異顯著，標(biāo)記為“*”。文中圖均采用EXCEL軟件處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，PAT對(duì)GES-1的生長具有一定抑制作用。1.0～10.0 μmol/L的PAT對(duì)GES-1細(xì)胞的存活率分別為92.93%、79.97%、70.54%、59.96%、19.12%，即當(dāng)PAT濃度低于10.0 μmol/L時(shí)，隨著PAT濃度的增加，GES-1細(xì)胞存活率逐步降低。

盡管，中國古代社會(huì)管理與“以人為本”的現(xiàn)代社會(huì)管理不可相提并論，但在中國歷史上至少相當(dāng)長的一段時(shí)期內(nèi)不失為一種有效的社會(huì)管理模式。至今，對(duì)于現(xiàn)代人在創(chuàng)新社會(huì)管理體制，探尋新的社會(huì)管理模式上仍然具有一定的歷史啟迪意義。

圖1 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The effect of PAT on cell viability of GES-1

2.2 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞凋亡的影響

由圖2可知，未經(jīng)PAT處理的細(xì)胞形態(tài)完整，核染色區(qū)成橢圓形態(tài)，且細(xì)胞邊緣清晰。當(dāng)PAT濃度為1.0 μmol/L時(shí)，細(xì)胞未見明顯核濃縮現(xiàn)象，染色未見明顯加深。當(dāng)PAT濃度增為2.5 μmol/L時(shí)，部分細(xì)胞可見體積增大或外形皺縮，且視野內(nèi)顯見染色加深現(xiàn)象，部分細(xì)胞核染色質(zhì)成新月形聚集于核膜一側(cè)。當(dāng)PAT濃度為5.0和7.5 μmol/L時(shí)，視野內(nèi)可見圓形核染色區(qū)，細(xì)胞膜界限模糊不可分辨。當(dāng)PAT濃度為10.0 μmol/L時(shí)，可見被細(xì)胞膜包繞的圓形小體。檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)PAT濃度為2.5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞處于凋亡早期，當(dāng)c(PAT)≥7.5 μmol/L后，細(xì)胞處于凋亡晚期。

A-0;B-1.0;C-2.5;D-5.0; E-7.5；F-10.0 μmol/L圖2 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 Effect of PAT on the morphology of GES-1 cells

2.3 PAT對(duì)Bax和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

EDLICH[14]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2家族的表達(dá)和調(diào)控在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。Bcl-2家族中Bax和Bcl-2是一對(duì)功能基因，前者是典型的促凋亡基因，而后者為抗凋亡基因。與對(duì)照組相比，PAT處理后Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量上調(diào)(圖3)，其中1.0 μmol/L組增幅不顯著，2.5～10.0 μmol/L均顯著增高(P<0.05)；而Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量在2.5～10.0 μmol/L均顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)合圖1和圖2結(jié)果可以看出，PAT處理濃度≥2.5 μmol/L時(shí)能夠引發(fā)GES-1細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生。

圖3 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of PAT on the relative expression levels ofBax and Bcl-2 mRNA in GES-1 cells

2.4 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞SOD活性的影響

圖4 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞T-SOD活性的影響Fig.4 Effect of PAT on the activity of T-SOD inGES-1 cells

2.5 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞CAT活力的影響

CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，從而使細(xì)胞免遭H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[17]。LI等[18]研究發(fā)現(xiàn)，彭澤鯽魚受鎘刺激后體內(nèi)有活性氧產(chǎn)生且CAT酶含量和活性增加，由此驗(yàn)證了CAT在抗氧化防御系統(tǒng)中的重要作用。AROCKIARAJ等[19]在羅氏沼蝦中也有類似發(fā)現(xiàn)。

由圖5可知，與對(duì)照組相比，處理組中1.0、5.0、7.5、10.0 μmol/L組差異顯著(P<0.05)。經(jīng)過1.0 μmol/L PAT處理后，CAT檢測(cè)值有明顯增長，這可能是由于此時(shí)PAT的處理濃度激發(fā)了細(xì)胞的CAT防御系統(tǒng)，引起CAT酶合成量增加，從而使得CAT檢測(cè)值比對(duì)照組高且差異顯著(P<0.05)。而當(dāng)PAT處理濃度≥2.5 μmol/L時(shí)，CAT檢測(cè)值下降，可能是由于PAT處理后，引發(fā)細(xì)胞氧化損傷，引起CAT大量消耗；另外，PAT處理后引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，CAT隨內(nèi)容物一起泄露至外環(huán)境中。

圖5 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞CAT活力的影響Fig.5 Effect of PAT on the activity of CAT in GES-1 cells

2.6 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞GSH含量的影響

GSH在細(xì)胞內(nèi)主要以還原性谷胱甘肽存在，GSH結(jié)構(gòu)中半胱氨酸側(cè)鏈基團(tuán)上連有一個(gè)活潑巰基[20]，可與過氧化物和自由基結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使組織免受自由基損害[21]。

由圖6結(jié)果可知，經(jīng)PAT處理后GES-1細(xì)胞GSH值逐步降低，且2.5～10.0 μmol/L處理組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。當(dāng)c(PAT)≥5.0 μmol/L時(shí)，GSH檢測(cè)值下降幅度超過42.71%，當(dāng)濃度增大至10.0 μmol/L，GSH值降幅達(dá)到56.54%。結(jié)果表明，PAT引起了GES-1內(nèi)氧化還原水平的改變，致使GSH含量大量下降，且隨著PAT濃度增加，細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷程度加劇。

圖6 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞GSH含量的影響Fig.6 Effect of PAT on the content of GSH inGES-1 cells

2.7 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞MDA含量的影響

細(xì)胞內(nèi)MDA含量能夠反映胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接的反映出細(xì)胞損傷的程度[22]。由圖7可知，隨著PAT處理濃度的增加，MDA含量急速升高。與對(duì)照組相比，2.5～10.0 μmol/L處理組差異顯著(P<0.05)，且當(dāng)c(PAT)≥5.0 μmol/L時(shí)，MDA含量增幅超過2倍。結(jié)果表明，PAT會(huì)引發(fā)GES-1細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致MDA積累，引發(fā)GES-1細(xì)胞的氧化損傷，在一定程度上促進(jìn)了GES-1細(xì)胞的變形、畸形和碎裂。

圖7 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞MDA含量的影響Fig.7 The effect of PAT on the content of MDA inGES-1 cells

2.8 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)量的影響

研究表明，組蛋白H2AX在DNA損傷修復(fù)和基因組穩(wěn)定性的維持中起重要的作用，γ-H2AX的形成是DNA雙鏈斷裂的一個(gè)標(biāo)志，伴隨DNA雙鏈斷裂的發(fā)生而出現(xiàn)[23]。由圖8可以看出，γ-H2AX隨著PAT濃度的增加表達(dá)量明顯上調(diào)，由此表明細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生了損傷，并且隨著PAT濃度的增加DNA損傷程度增大。

3 結(jié)論

a、b、c、d-PAT處理量依次為0、2.5、5.0、7.5 μmol/L圖8 PAT對(duì)GES-1細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)量的影響Fig.8 Protein expression of γ-H2AX varied in responseto PAT in GES-1 cells

經(jīng)不同濃度PAT體外處理后，GES-1細(xì)胞核、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞內(nèi)部氧化還原系統(tǒng)發(fā)生了不同程度的改變。當(dāng)c(PAT)≥2.5 μmol/L時(shí)，對(duì)GES-1細(xì)胞抑制率大于20%，熒光染色鏡檢發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡特征；同條件下，Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量上調(diào)，而Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，表明GES-1細(xì)胞進(jìn)入了凋亡階段。同時(shí)，和對(duì)照組相比，與氧化還原系統(tǒng)相關(guān)的SOD、CAT檢測(cè)值降幅最高可達(dá)53.76%，GSH檢測(cè)值降幅最高可達(dá)56.55%，而MDA最低增幅為139.59%，指標(biāo)變化趨勢(shì)與細(xì)胞凋亡發(fā)展趨勢(shì)一致。依據(jù)本文研究結(jié)果得出PAT體外處理對(duì)GES-1細(xì)胞損傷機(jī)制可能是：初期激發(fā)GES-1細(xì)胞抗氧化損傷機(jī)制，引起DNA損傷、MDA等有害物質(zhì)累積，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，引發(fā)了細(xì)胞凋亡機(jī)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解、凋亡。