堿性蛋白酶酶解醬油渣蛋白制備免疫活性肽

于志成，黃福氣，許宙，程云輝

(長沙理工大學 化學與食品工程學院，湖南 長沙，410114)

醬油發酵后經壓榨或抽油產生的剩余殘渣即為醬油渣[1]。據中國調味品協會統計，2017年我國醬油產量接近860萬t[2]，按照每生產1 t醬油產生0.67 t醬油渣計算，醬油渣年產量可達580萬t,而醬油渣原料中富含蛋白質、纖維素、脂肪等營養成分，容易發生腐敗變質，處理不當還會污染環境[3]。目前醬油渣再利用的主要途徑是飼料或飼料添加物，由于其中鹽分和油脂含量較高，在一定程度上限制了醬油渣飼料的應用[4]。

醬油生產過程中大豆中的蛋白質利用率在60%左右[5]，部分蛋白質還殘留在醬油渣中。經測定，醬油渣中蛋白質含量約為26%(干基)。近年來，已有學者對醬油渣中蛋白質的性質[6]、多肽的提取工藝[7-8]及提取物的抗氧化活性[9-11]進行了研究，但對醬油渣中蛋白質進行酶解，制備免疫活性肽[12-13]的研究鮮有報道。本研究采用條件溫和、安全系數高、可控性強、生產可規模化等優點的酶解法[14]制備免疫活性肽[15-16]，使用單因素和響應面優化試驗探究堿性蛋白酶酶解醬油渣蛋白制備免疫活性肽的最優工藝條件，以期為充分利用醬油渣資源，實現廢物再利用，開發綠色、安全、高效的食源性免疫制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油渣,湖南加加醬油股份有限公司；RAW264.7小鼠巨噬細胞,贏潤生物技術有限公司；石油醚,國藥集團化學試劑有限公司；福林酚,合肥博美生物科技責任有限公司；L-酪氨酸,上海哈靈生物科技有限公司；堿性蛋白酶(27.6×104U/g),諾維信公司；D201C大孔吸附樹脂,江蘇蘇青有限公司；96孔培養板，康寧公司corning公司；JJ-T電動攪拌器，江蘇國勝實驗儀器有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器有限公司；EV 311旋轉蒸發器，河南予華儀器有限責任公司；FD-1真空冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；HHCP-01二氧化碳細胞培養箱，上海博訊醫療設備廠；MLS-3 750滅菌鍋，日本三洋有限公司；DNM-9 602酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 醬油渣的預處理

將醬油渣原料在60 ℃烘箱中烘干，粉碎后過60目篩，石油醚脫脂，干燥后備用。

1.2.2 醬油渣蛋白的提取制備

1 kg脫脂醬油渣溶于10 L蒸餾水中，用2 mol/L NaOH調節溶液pH至10→室溫攪拌2 h→離心(3 500 r/min,30 min)→取上清液→用2 mol/L HCl滴定至pH 4.0→離心(3 500 r/min,10 min)→水洗3次(3 500 r/min，10 min)→取沉淀→冷凍干燥備用[7]

1.2.3 醬油渣蛋白酶解物的制備

醬油渣蛋白懸浮液→50 ℃恒溫攪拌30 min→調至酶最適溫度→調至酶最適pH→加酶酶解→滅酶活力(15 min，90 ℃)→離心取上清液→大孔吸附樹脂脫鹽→真空濃縮→冷凍干燥[7]

1.2.4 酶解物對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)炎癥模型細胞內NO釋放量影響的測定

當培養皿中的小鼠巨噬細胞生長到對數期時，棄掉培養皿中的細胞培養基上清液，用1 mL移液槍分2次吸取2 mL培養基將培養皿中貼壁的細胞輕輕吹下，12 000 r/min、4 ℃離心收集細胞，在96孔培養板中接種3×104個/孔的細胞，每孔200 μL細胞液，在37 ℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，以6復孔為一組，分為陰性對照組、LPS炎癥模型組、陽性對照組和醬油渣蛋白酶解物預處理組，參考文獻[17]，具體如下：

(1)陰性對照組：加入含體積分數10%的胎牛血清的DMEM培養基；

(2)LPS炎癥模型組：加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，培養12 h，再加入用DMEM培養基稀釋的LPS溶液20 μL，培養24 h；

(3)陽性對照組：加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基，培養12 h，再加入用無菌水稀釋的免疫球蛋白(IgG)20 μL，培養24 h；

(4)醬油渣蛋白酶解物樣品預處理組：加入無菌水溶解的樣品溶液，使樣品的終質量濃度為6.25 μg/mL，培養12 h，加入用DMEM培養基稀釋的LPS溶液，培養24 h。

收集小鼠巨噬細胞培養基上清液，在12 000 r/min、4 ℃低溫離心5 min以除去細胞雜質。根據格里斯(GRIESS)法測定上清液中NO含量。其中NO抑制率如公式(1)所示：

(1)

式中：C1,LPS刺激產生NO濃度；C2,樣品預處理后產生的NO濃度。

1.2.5 醬油渣蛋白酶解工藝的單因素試驗

1.2.5.1 底物濃度對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

固定反應條件酶解時間3 h、加酶量6 000 U/g、溫度55 ℃、pH 8.0，設定底物質量分數為1.25%、2.5%、5%、7.5%、10%，以脂多糖炎癥模型中小鼠巨噬細胞內NO的釋放量為考察指標，考察不同底物濃度酶解所得酶解物對RAW264.7細胞內NO釋放量的影響。

1.2.5.2 pH對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

固定反應條件:酶解時間3 h、加酶量6 000 U/g、溫度55 ℃、底物質量分數5%，設定pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，以脂多糖炎癥模型中小鼠巨噬細胞內NO的釋放量為考察指標，考察不同pH下酶解所得酶解物對RAW264.7細胞內NO釋放量的影響。

1.2.5.3 酶解溫度對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

固定反應條件:酶解時間3 h、加酶量6 000 U/g、底物質量分數5%、pH 8.0,設定酶解溫度為45、50、55、60、65 ℃，以脂多糖炎癥模型中小鼠巨噬細胞內NO的釋放量為考察指標，考察不同溫度下酶解所得酶解物對RAW264.7細胞內NO釋放量的影響。

1.2.5.4 酶解時間對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

固定反應條件:加酶量6 000 U/g、溫度55 ℃、pH 8.0、底物質量分數5%，設定酶解時間為1、2、3、4、5 h，以脂多糖炎癥模型中小鼠巨噬細胞內NO的釋放量為考察指標，考察不同時間下酶解所得酶解物對RAW264.7細胞內NO釋放量的影響。

1.2.5.5 加酶量對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

固定反應條件:酶解時間3 h、溫度55 ℃、pH 8.0、底物質量分數5%，設定加酶量為5 000、5 500、6 000、6 500、7 000 U/g，以脂多糖炎癥模型中小鼠巨噬細胞內NO的釋放量為考察指標，考察不同加酶量時酶解所得酶解物對RAW264.7細胞內NO釋放量的影響。

1.2.6 響應面試驗

根據單因素試驗結果，確定出堿性蛋白酶酶解醬油渣蛋白所得酶解物對LPS炎癥模型細胞內NO釋放量抑制作用的酶解工藝中有顯著影響的3個因素：酶解溫度、酶解時間及加酶量。運用Design Expert 10.0軟件的Box-Behnken試驗設計，對以上3個因素做進一步分析，確定各因素的最佳取值，各因素及水平取值如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Response surface test factors and levels

2 結果與分析

2.1 酶解工藝條件的優化

2.1.1 底物濃度對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

由圖1可知，當底物質量分數在1.25%～5%范圍內時，小鼠巨噬細胞內NO的濃度隨著底物濃度的升高而降低；底物質量分數在5%以上時，細胞內NO濃度增加。在酶解體系里底物濃度未飽和前，酶解程度與底物濃度存在正相關性[18]。而繼續增加底物濃度，體系中的黏稠度上升，蛋白質分子的擴散受到阻礙，導致酶與蛋白質的結合效率下降，進而造成免疫活性肽的釋放速率降低。當底物質量分數為5%時，細胞內NO的濃度最小且極顯著低于陽性對照組IgG，因此本研究選擇底物質量分數為5%。

圖1 底物質量分數對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on NO concentrationin RAW264.7 cells注：##：與陰性對照組比有極顯著差異(P<0.01)；*：與LPS組比有顯著差異(P<0.05)；**：與LPS組比有極顯著差異(P<0.01)；樣品質量濃度均為6.25 μg/mL(下同)

2.1.2 pH對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

由圖2可知，當pH值為7.5時，小鼠巨噬細胞內NO的濃度最低；pH>7.5時，細胞內NO的濃度升高。這可能是因為較高的pH環境對蛋白質的空間結構產生影響。由于pH的不斷升高，高凈電荷引起強烈的分子靜電排斥作用，使醬油渣蛋白質分子膨脹和伸展，埋藏在醬油渣蛋白質分子內部的部分羧基、酚羥基和巰基產生離子化，暴露在水環境中的離子基團導致多肽鏈分散，蛋白酶活性部位和醬油渣蛋白的解離受到抑制，進而影響了醬油渣蛋白中免疫活性肽的釋放[14]。因此，選擇在pH 7.5的環境下對醬油渣蛋白進行酶解。

圖2 pH對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.2 Effect of pH on NO concentration in RAW264.7 cells

2.1.3 酶解溫度對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

由圖3可知，酶解溫度在45～60 ℃范圍內，小鼠巨噬細胞內NO濃度隨著溫度的升高而降低，而當溫度>60 ℃時，小鼠巨噬細胞內NO濃度增加。這是因為當溫度升高時有利于酶的激活，使得細胞內NO的濃度明顯降低；而溫度過高容易導致部分蛋白酶變性失活[19-20]。當溫度在60 ℃時，酶解物對小鼠巨噬細胞內NO的釋放量抑制效果最好且顯著優于陽性對照組，因此本研究選擇在60 ℃條件下對醬油渣蛋白進行酶解。

圖3 酶解溫度對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on NO concentrationin RAW264.7 cells

2.1.4 酶解時間對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

由圖4可知，在1～3 h內，小鼠巨噬細胞內NO的濃度隨著酶解時間的延長而降低，當酶解時間超過3 h時，小鼠巨噬細胞內NO濃度增加。由此推測，隨著時間的延長醬油渣蛋白會被過度水解。當在3 h時小鼠巨噬細胞內NO濃度最小且顯著低于陽性對照組，故本研究將酶解時間定為3 h。

圖4 酶解時間對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on NO concentration inRAW264.7 cells

2.1.5 加酶量對小鼠巨噬細胞內NO釋放量的影響

由圖5可知，當加酶量為5 500 U/g時，小鼠巨噬細胞內NO濃度最小且極顯著低于陽性對照組，繼續往體系中添加堿性蛋白酶，小鼠巨噬細胞內NO濃度逐漸升高。隨著加酶量的不斷增加，同種酶之間產生了競爭關系，對醬油渣蛋白與堿性蛋白酶的結合產生了影響[14]，酶解醬油渣蛋白釋放免疫活性肽受到抑制。因此，本研究將加酶量定為5 500 U/g。

圖5 加酶量對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.5 Effect of enzyme amount on NO concentration inRAW264.7 cells

2.2 酶解工藝的響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，固定pH為7.5、底物質量分數為5%，以酶解溫度、酶解時間及加酶量3個因素為自變量，酶解物對LPS炎癥模型細胞內NO釋放量的濃度為響應值，運用Design Expert10.0軟件的Box-Behnken試驗設計進行響應面優化試驗，試驗設計和結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計和結果Table 2 Response surface experiment design and results

對表2中的試驗結果進行回歸分析，得到RAW264.7細胞內NO的濃度值(Y)與酶解溫度(A)、酶解時間(B)、加酶量(C)之間的二次多元回歸擬合方程為：

Y=22.88-0.35A+0.23B+0.31C+1.00AB-0.37AC-0.47BC+0.90A2+1.81B2+2.33C2

對試驗結果進行多元回歸分析，由回歸方程各項的方差分析結果(表3)可知，模型的F=80.97，p<0.000 1，表明模型極顯著，同時A-酶解溫度是極顯著因素，A-酶解溫度、B-酶解時間和C-加酶量的二次方、A-酶解溫度與B-酶解時間的交互作用、B-酶解時間與C-加酶量的交互作用也是極顯著影響；B-酶解時間、C-加酶量、A-酶解溫度與C-加酶量的交互作用是顯著影響。而失擬項的F=6.33，P=0.053 4，不顯著(P>0.05)，說明該模型與堿性蛋白酶酶解醬油渣蛋白制備免疫活性肽的實際情況擬合程度較好；擬合模型的R2=0.990 5，表明試驗數據與模型預測數據相關性很好。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

注：*為P<0.05，具有顯著性；**為P<0.01，具有極顯著性

圖6～圖8為以上模型所對應的響應面曲面圖，從外形可以清晰看出擬合的響應面是典型的凹面圖，其所對應的等高線圖呈現向內遞減的變化趨勢，其中心點即有最小的響應值。運用軟件的優化算法可確定出最小的響應值為小鼠巨噬細胞內NO濃度為22.81 μmol/L，抑制率為19.43%，此時各因素對應值分別為：加酶量5 468 U/g，酶解時間2.86 h，酶解溫度61.31 ℃。

圖6 時間與溫度對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.6 Effect of time and temperature on NO concentrationin RAW264.7 cells

圖7 加酶量與溫度對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.7 Effect of enzyme amount and temperature on NOconcentration in RAW264.7 cells

圖8 加酶量與時間對RAW264.7細胞內NO濃度的影響Fig.8 Effects of enzyme amount and time on NOconcentration in RAW264.7 cells

綜合以上單因素和響應面優化的試驗結果確定堿性蛋白酶酶解醬油渣蛋白制備免疫活性肽的工藝條件為：底物質量分數5%，pH 7.5，溫度 61.31 ℃，酶解時間2.86 h，加酶量 5 468 U/g。在此條件下，醬油渣蛋白酶解物的小鼠巨噬細胞內NO釋放量的抑制率可達18.92%。結合生產實際，調整醬油渣蛋白酶解工藝條件為：底物質量分數5%，pH 7.5，溫度60 ℃，酶解時間 2.9 h，加酶量 5 500 U/g，在此條件下進行驗證試驗，3次獨立試驗的平均抑制率為(18.93±0.22)%，這與模型的預測值基本一致，進一步驗證了上述模型的可靠性。

3 結論

通過酶解法制備醬油渣蛋白免疫活性肽，在單因素試驗基礎上，運用響應面法進行優化，得到最佳工藝條件為：底物質量分數5%，pH7.5，溫度60 ℃，酶解時間2.9 h，加酶量5 500 U/g。此條件下，酶解物對LPS炎癥模型細胞內NO釋放量的抑制率可達(18.93±0.22)%。結果表明通過優化酶解工藝提高了醬油渣蛋白酶解產物的免疫活性，為食源性免疫制劑的進一步研究提供理論依據。