機械化大罐發酵干型黃酒釀造過程中風味物質的變化

謝廣發，蔡際豪，錢斌，王蘭，魯振東，呂飛*，丁玉庭*

1(浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 紹興，312028) 2(浙江工業大學 食品科學與工程學院，浙江 杭州，310000) 3(國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000) 4(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

黃酒是我國的民族特產，具有悠久的歷史。傳統的黃酒釀造是以自然培養酒母和麥曲作糖化發酵劑，發酵周期長達70～90 d，出酒率低，設備利用率低，勞動強度大，且受季節性影響較大[1-2]。機械化釀造以大罐代替缸、壇，進行前、后發酵，用機械化、管道化代替原來的人工輸送，用純種酵母和麥曲代替或部分代替自然培養的淋飯酒母和塊曲。機械化黃酒釀造具有占地面積小、質量相對穩定、勞動生產率高、勞動強度低等優點，逐漸被黃酒企業所采用，被認為是今后黃酒發展的方向[3-5]。

由于黃酒獨特的原料和釀造工藝，使其具有獨特且復雜的香氣特征，黃酒主要風味成分有揮發性物質、有機酸、多酚、脂肪酸、糖類、氨基酸等[6-7]。原料、糖化發酵劑、釀造過程、貯藏時間等都影響著黃酒中風味成分的形成[8]。近年來，黃酒風味物質及其形成機制的研究越來越受到重視。LIU等[9]和HUANG等[10]研究了黃酒發酵中風味物質與微生物群落的相關性，找到了產生特征風味物質的關鍵微生物群落；YANG等[11]通過培育耐乙醇和活性高的酵母來改善黃酒風味，得到香氣和口感更佳的黃酒；馮愛軍等[12]采用HPLC法對客家娘酒及紹興黃酒中10種有機酸進行定性、定量分析，結果表明不同酒種、不同品牌的酒中所含有機酸的種類和數量存在一定的差異；李國輝等[13]建立了以N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺為衍生試劑的GC-FID方法，并測定了黃酒中17種游離氨基酸；WANG等[14]利用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術(HS-SPME-GC-MS)、高效液相色譜法對紹興地區黃酒發酵過程不同階段風味物質的變化進行了研究，并對細菌群落結構和風味物質的相關性進行了分析；洪家麗等[15]和郭偉靈等[16]研究紅曲黃酒傳統釀造過程中的揮發性風味及菌群結構動態變化規律。

隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強，干型黃酒越來越受到消費者青睞，但上述研究主要針對半干型或甜型黃酒[17-20]，而對于干型黃酒風味物質的組成及動態變化未見報道，這在一定程度上制約了干型黃酒產品質量的提高。本研究采用高效液相色譜及頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用對干型機械化黃酒中的揮發性組分、有機酸、氨基酸等進行初步分析測定，并且利用主成分分析對不同發酵階段的風味物質進行差異性比較，以期為今后干型黃酒的風味研究和品質控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

機械化干型黃酒釀造過程不同階段發酵醪樣品，取自某大型紹興黃酒生產企業。取樣時間點為2、4、6、10、14、18 d，每個過程各取3批次，樣品經4層紗布過濾后存放于-4 ℃冰箱中，15 d內完成分析。

1.2 儀器與設備

E2695型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)，美國Waters公司；TRACE1300-ISQQD氣相色譜質譜聯用儀，賽默飛世爾科技公司；固相微萃取裝置(配50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭)，美國Supelco公司；HYJD超純水器，杭州永潔達凈化科技有限公司；FA2004型電子分析天平，常州市衡正電子儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 常規理化指標的測定

總酸、還原糖、酒精度：分別采用酸度計法、廉愛農法、酒精計法測定[21-22]。

1.3.2 揮發性風味物質的測定[23-24]

1.3.2.1 頂空固相微萃取條件

不同階段樣品先經3 000 r/min離心20 min，取5 mL離心后的樣品，放入20 mL頂空瓶，加入5 μL內標物(2-辛醇，質量濃度為89.65 μg/L)，2.5 g NaCl，萃取溫度50 ℃，預熱15 min，萃取時間40 min，GC解吸5 min(250 ℃)。

1.3.2.2 GC-MS 條件

色譜條件：色譜柱型號為DB-Wax毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱初始溫度40 ℃保持5 min，以5 ℃/min的速度上升至150 ℃，再以10 ℃/min的速度上升至230 ℃，然后保持10 min。載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，進樣方式為不分流進樣。

質譜條件：接口溫度為230 ℃，電子轟擊EI離子源，掃描范圍(m/z)為30～550 amu，電子能量為70 eV，離子源溫度是230 ℃。

1.3.3 有機酸含量的測定

1.3.3.1 樣品預處理

取5 mL離心后的樣品倒入25 mL容量瓶中，用流動相定容到刻度，然后經0.22 μm膜過濾，直接進樣。

1.3.3.2 色譜條件[25-26]

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.08 mol/L KH2PO4溶液(用H3PO4調節pH至2.80)；流速0.8 mL/min；進樣量20 μm；檢測波長215 nm；柱溫30 ℃。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

1.3.4.1 樣品預處理

取標樣(半胱氨酸為1.25 mmol/L，其余16種氨基酸濃度為2.5 mmol/L)或離心后的樣品50 μL，置于2 mL離心管中，加150 μL高純水，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL、1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，混勻。室溫下放置1 h后，加入400 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。棄去上層正己烷溶液，下層溶液經0.22 μm濾膜過濾后進樣，進行色譜分析。

1.3.4.2 色譜條件[27-28]

色譜柱：Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫38 ℃；檢測波長254 nm；流量1 mL/min；進樣量10 μL；流動相：A 0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液，B 1 mol/L三乙胺乙腈溶液，C體積分數1%的乙酸溶液，D醋酸鈉緩沖鹽溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度程序Table 1 Gradient program

1.3.5 數據處理

用EXCEL 2007進行數據整理，用SPSS 17.0進行主成分分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 干型黃酒釀造過程中理化指標變化

干型黃酒釀造過程中理化指標變化如圖1 所示。隨著糖化發酵的進行，酒精度和總酸一直呈上升趨勢，還原糖呈下降趨勢，但后期變化趨于緩慢，變化規律與其他類型黃酒基本一致[29-30]。在發酵初期，發酵醪中的酒精度和總酸都處于較低水平且發酵所需營養充足，酵母、產酸菌等微生物大量繁殖，導致酒精度和總酸較快上升，還原糖消耗較快；隨著發酵的進行，營養物質逐漸被消耗，酒精度和總酸含量也達到一定水平，對酵母和產酸菌的活動有一定抑制作用，酒精度、總酸和還原糖的變化也趨于緩慢。

圖1 半干型黃酒釀造理化指標的變化曲線Fig.1 Changes in physicochemical indices during dryHuangjiu brewing process

2.2 干型黃酒釀造過程揮發性風味物質變化

干型黃酒釀造過程中樣品揮發性風味物質檢測結果和變化趨勢分別見表2和圖2，各種風味物質含量采用內標半定量得到。不同階段樣品中檢出的主要揮發性風味物質有醇類、醛類、酸類和酯類。醇類主要為異戊醇和β-苯乙醇，發酵2 d達到74.34和65.42 mg/L，釀造中后期醇類(高級醇)略有減少。一般認為，高級醇是酵母增殖的副產物，前期酵母大量增殖，生成的高級醇較多，而中后期酵母增殖少，生成的高級醇少[31-32]。由于黃酒發酵是敞口發酵，且釀造過程中需要用壓縮空氣開耙，造成高級醇揮發損失，同時部分醇類物質與有機酸作用生成酯類物質，使高級醇含量略有下降。醛類化合物在2 d含量達到最高，之后呈下降趨勢，檢測到的醛類有苯甲醛、苯乙醛、糠醛、壬醛、癸醛、2-苯基-2-丁烯醛和5-甲基糠醛7種。酯類物質種類最多，檢測到20種，主要為乙酯類和乙酸酯類。酯類在釀造前期生成較快，后期緩慢上升，主要酯類物質乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯在14 d達到37.76、24.56、25.12 mg/L。揮發酸檢測到4種，分別是乙酸、己酸、戊酸和辛酸。

香氣物質的貢獻多以香氣活力值，即含量與香氣閾值的比值來評價。醇類中β-苯乙醇和丁醇的香氣閾值分別為28和2.7 mg/L；醛類中苯甲醛、壬醛的香氣閾值分別為1和0.12 mg/L；酯類中乙酸乙酯的香氣閾值為32 mg/L、丁酸乙酯為0.081 mg/L、戊酸乙酯為0.027 mg/L、己酸乙酯為0.055 mg/L、辛酸己酯為0.02 mg/L、γ-壬內酯為0.09 mg/L、苯甲酸乙酯為1.4 mg/L、苯乙酸乙酯為0.1 mg/L；揮發酸中乙酸和戊酸的香氣閾值分別為2.5和0.39 mg/L[33-35]，這些揮發性風味物質在干型酒中的香氣活力值較大，可能對干型黃酒的風味形成有較大的貢獻。

表2 干型黃酒釀造過程揮發性風味成分含量的變化Table 2 Changes in volatile flavor components content during dry Huangjiu brewing process

注：“-”表示未檢出

圖2 半干型黃酒釀造過程中揮發性風味物質變化曲線Fig.2 Changes in volatile flavor components content duringdry Huangjiu brewing process

2.3 干型黃酒釀造過程揮發性風味物質的PCA分析

以18個樣品的46種揮發性成分含量構成18×46的矩陣，利用SPSS17.0進行主成分分析，按照剔除最小特征值的主成分中對應的最大特征向量的變量的原則，一次剔除一個變量，然后利用剩余變量再進行主成分分析，經過有限次剔除后，保留的成分有苯甲酸乙酯、丙醇、壬醇、戊酸、戊酸乙酯、異戊醇、壬醛、乙酸苯乙酯、苯乙醇、苯甲醇、2,3-丁二醇、辛醇、乙酸己酯、甲酸苯乙酯、丁二酸單乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸異戊酯、糠醇、γ-壬內酯，辛酸、己酸。提取的第一、二主成分的方差貢獻率累計達到了86.47%，其中第一主成分(PC1)構成的信息量占總信息量的58.82%，第二主成分(PC2)占27.65%，如圖3所示。

由圖3可知，2 d位于第二象限，主要特征揮發性成分為苯甲酸乙酯、丙醇、壬醇、戊酸、戊酸乙酯、壬醛；4 d與6 d均位于第一象限，主要特征揮發性成分為乙酸苯乙酯、苯乙醇、異戊醇、苯甲醇、2,3-丁二醇、辛醇、乙酸己酯、甲酸苯乙酯；10、14和18 d均位于第四象限，主要特征揮發性成分為丁二酸單乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸異戊酯。發酵前期與后期樣品的揮發性成分差異性較大，前期位于X軸的上方，后期位于下方。2、4、6 d的點可以很好區分開，而10、14、18 d的點較為聚攏，表明在發酵前期樣品的揮發性風味物質變化比較大，發酵后期變化趨于平緩。

A1-丙醇；A3-異戊醇；A4-β-苯乙醇；A5-2,3-二丁醇；A7-辛醇；A8-壬醇；A9-糠醇；A14-苯甲醇；B1-乙酸乙酯;B2-乳酸乙酯;B3-丁酸乙酯;B4-丙酸乙酯;B5-戊酸乙酯;B6-己酸乙酯;B10-γ-壬內酯;B13-乳酸異戊酯;B14-丁二酸單乙酯;B15-苯甲酸乙酯;B16-甲酸苯乙酯;B17-苯乙酸乙酯;B18-乙酸苯乙酯;C4-壬醛;D2-己酸;D3-戊酸;D4-辛酸圖3 干型黃酒釀造過程揮發性風味物質主成分載荷圖Fig.3 PCA loading plot of volatile flavor componentsduring dry Huangjiu brewing process

2.4 干型黃酒釀造過程有機酸含量變化

有機酸是黃酒中重要的呈味物質，有增強黃酒的濃厚感，降低甜度等作用[25,36]。實驗共測定7種有機酸，分別是乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸和丙酮酸，其含量和變化趨勢如表3所示。

表3 干型黃酒釀造過程有機酸含量的變化 單位：mg/L

在干型黃酒釀造過程中，有機酸總量呈增加趨勢，其中含量最高的有機酸是乳酸，18 d為3 427.5 mg/L。酒石酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸在發酵過程中一直呈上升趨勢，其中檸檬酸和蘋果酸參與三羧酸循環，不會大量積累，其含量遠低于乳酸和乙酸。乙酸含量在發酵過程中先增后減，在第10天達到最大值，為787.5 mg/L，可能由于揮發和酯化反應所致。所有的有機酸中，丙酮酸含量最低，最高含量僅為28.9 mg/L，這是因為丙酮酸作為糖酵解最后一步的產物，是諸多代謝產物的前體，在發酵過程中會被大量消耗。

2.5 干型黃酒釀造過程氨基酸含量變化

氨基酸具有獨特的滋味，如谷氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等呈鮮味; 絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸等呈甜味; 酪氨酸呈澀味；異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸、精氨酸等呈苦味[37-38]。如表4所示，在干型黃酒釀造過程中，游離氨基酸含量一直呈上升趨勢，發酵第18天達到2 234.4 mg/L。這與傳統半干型黃酒釀造過程的氨基酸變化規律不同，傳統半干型黃酒在釀造前期氨基酸含量緩慢上升，而在后期發酵最后1個月氨基酸含量快速上升[28]。氨基酸在發酵前期主要由原料帶入以及原料蛋白質酶解產生，后期與酵母菌、霉菌等微生物自溶有關。干型黃酒中含量較高的游離氨基酸是丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸，第18天分別達到428.7、355.6、243.6、201.8和201.9 mg/L，多為甜味和苦味氨基酸。由于氨基酸的種類和含量對黃酒的口味有重要影響，所以氨基酸譜的差異性已被應用于黃酒的鑒定[39]，如何通過對釀造過程中氨基酸的調控來得到具有特定風味的黃酒的問題還有待今后進一步研究。

表4 干型黃酒釀造過程游離氨基酸含量變化 單位：mg/L

2.6 半干型黃酒釀造過程氨基酸和有機酸的PCA分析

以18個樣品的23種有機酸與游離氨基酸含量構成18×23的矩陣，利用SPSS 17.0進行主成分分析，按照剔除最小特征值的主成分中對應的最大特征向量的變量的原則，一次剔除一個變量，然后利用剩余變量再進行主成分分析，保留的成分有乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸、丙酮酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸。提取的第一、二主成分的方差貢獻率累計達到了74.14%，其中第一主成分(PC1)構成的信息量占總信息量的47.21%，第二主成分(PC2)占26.93%，如圖4所示。

由圖4可知，發酵2 d與4 d均位于第二象限，主要特征成分為天門冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸；6 d與10 d位于第一象限，主要特征成分為酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、谷氨酸、脯氨酸；14 d與18 d位于第四象限，主要特征成分為醋酸、乳酸、丙氨酸、組氨酸和精氨酸。每一發酵階段的點都能很好分開，表明每一發酵階段的有機酸和氨基酸含量差異明顯。2、4、6 d的點距離10、14、18 d的點分開較遠，發酵前期與發酵后期可以較好區分。丙酮酸與第一主成分呈負相關，乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸和琥珀酸與第一主成分呈現較高正相關。

F1-乙酸;F2-乳酸;F4-蘋果酸;F5-酒石酸;F6-琥珀酸;F7-丙酮酸;G1-天門冬氨酸;G2-蘇氨酸;G4-谷氨酸;G5-脯氨酸;G7-丙氨酸;G8-纈氨酸;G10-異亮氨酸;G11-亮氨酸;G14-賴氨酸;G15-組氨酸;G16-精氨酸圖4 半干型黃酒釀造過程有機酸和游離氨基酸主成分載荷圖Fig.4 PCA loding plot of organic acids and free aminoacids during semi-dry Huangjiu brewing process

3 結論

干型機械化黃酒揮發性風味物質含量在發酵前4 d快速上升，后期上升緩慢，2 d的主要特征揮發性組分為苯甲酸乙酯、丙醇、壬醇、戊酸、戊酸乙酯、壬醛，4 d與6 d主要特征揮發性組分為乙酸苯乙酯、苯乙醇、異戊醇、苯甲醇、2,3-丁二醇、辛醇、乙酸己酯、甲酸苯乙酯，10 d后主要特征揮發性組分為丁二酸單乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸異戊酯。有機酸和游離氨基酸總含量呈增長趨勢，2 d與4 d主要特征成分為天門冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸，6 d與10 d主要特征成分為酒石酸、琥珀酸、蘋果酸、谷氨酸、脯氨酸，14 d與18 d主要特征成分為醋酸、乳酸、丙氨酸、組氨酸和精氨酸。