貴州省新型冠狀病毒核酸檢測質(zhì)量現(xiàn)場考核結(jié)果分析

吳 嫻，馮勤穎，向 麗，黃 山，王濟林，孫建超，陶永德

貴州省臨床檢驗中心，貴州貴陽 550002

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的，確診的金標準是可在患者體內(nèi)檢測到SARS-CoV-2，而核酸檢測是檢測病毒基因中的某些特定核酸序列，因此從方法學層面考慮可將其作為實驗室診斷金標準[1]。ZHU等[2]在2020年1月通過高通量測序已證實SARS-CoV-2為一種β屬冠狀病毒，其基因組約含29 000個堿基，有12個蛋白編碼區(qū)/開放讀碼框(ORF)，包括1ab、S、3、E、M、7、8、9、10b、N、13、14；其中ORF 1ab編碼RNA聚合酶，可參與病毒核酸復(fù)制；N區(qū)編碼核殼蛋白，其與病毒基因組宿主RNA互相識別；E區(qū)編碼囊膜蛋白，與病毒包膜及病毒顆粒的形成相關(guān)[3-4]。

近期，SARS-CoV-2核酸檢測陽性率問題備受社會關(guān)注。貴州省為了切實做好“外防輸入、內(nèi)防擴散”工作，及時有效發(fā)現(xiàn)和控制傳染源，規(guī)定了對五類人員(疑似病例、確診病例的密切接觸者、每天發(fā)熱門診就診的發(fā)熱患者、湖北省武漢市等地返黔的居家隔離和集中隔離人員、每天由湖北省武漢市等地新來黔或返黔人員)開展全面核酸檢測。貴州省衛(wèi)生健康委員會在原來的10家疾控中心檢測實驗室的基礎(chǔ)上，新增21家醫(yī)療機構(gòu)和3家第三方檢驗機構(gòu)實驗室，作為全省SARS-CoV-2核酸檢測指定實驗室，共計34家。為保證檢測結(jié)果，了解各實驗室檢測能力以及檢測試劑的質(zhì)量狀況，貴州省臨床檢驗中心針對省內(nèi)34家SARS-CoV-2核酸檢測實驗室進行了技術(shù)考核，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果匯報如下。

1 材料和方法

1.1材料 本次考核品定制于相關(guān)生物制品公司，共有10批考核品，包括陰性、弱陽性和陽性樣品。陰性樣品為稀釋液；陽性樣品采用裝甲RNA技術(shù)，將3個目標RNA序列(含ORF 1ab、N和E基因)用噬菌體蛋白外殼加以包裹形成，其結(jié)構(gòu)類似于天然病毒，以還原真實的樣品，然后進行培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液，對收獲的假病毒培養(yǎng)液進行初步定值，然后用陰性稀釋液稀釋至所需水平；弱陽性樣品病毒拷貝數(shù)為所用6種試劑盒檢測限均值的3～5倍。陽性樣品大約為105拷貝/毫升，規(guī)格:1.0 毫升/管。所用考核樣品由專人按照冷藏條件送到各檢測實驗室，在事先不通知的情況下，在規(guī)定時間進行檢測和回報。

1.2方法

1.2.1試劑盒 本次考核一共涉及6個不同廠家生產(chǎn)的國產(chǎn)試劑盒，分為A～F 6組，其中A～E組檢測位點為ORF 1ab和N基因，F(xiàn)組除這2個基因外，還檢測E基因，6種試劑中，除一種使用一步法外，其余均用磁珠法進行病毒核酸提取，且6種試劑均采用熒光定量PCR法對靶基因進行檢測。

1.2.2檢測方法 各實驗室嚴格按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南(第二版)》[5]和《國家衛(wèi)生健康委辦公廳關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)的通知》[6]相關(guān)文件進行生物安全防護和實驗操作，并嚴格按照試劑說明書進行RNA的提取及擴增檢測。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1各檢測機構(gòu)考核品檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合程度 本次考核發(fā)放考核樣品34份，每份含10個樣品(3個陰性樣品，2個弱陽性樣品，5個陽性樣品)，規(guī)定時間內(nèi)回收結(jié)果30份。在完成考核的30家檢測機構(gòu)中，有22家使用試劑A，4家使用試劑B，試劑C、D、E和F各有1家實驗室選用。結(jié)果共涉及6個廠家試劑，且使用各試劑廠家檢測的結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果100%相符。這30家檢測機構(gòu)的檢測結(jié)果總符合率為100%，其中陽性樣品符合率、陰性樣品符合率、全省疾控機構(gòu)總符合率、全省醫(yī)療機構(gòu)總符合率、第三方機構(gòu)總符合率均為100%。考核結(jié)果見表1。

表1 各試劑檢測結(jié)果

2.26組試劑檢測結(jié)果 本次完成考核的實驗室中，22家使用試劑A，4家使用試劑B，其余實驗室均只涉及一個廠家試劑，所用考核品10批，且每家實驗室均完成了這10批考核品的檢測，其檢出結(jié)果見表2。由表可知，除1組試劑檢測ORF 1ab、N和E基因外，其余5組均檢測ORF 1ab和N基因，且各組試劑對靶基因的檢出率均為100%。

表2 6組試劑檢測結(jié)果

注：檢測次數(shù)為使用該試劑的實驗室數(shù)與考核品批數(shù)(10)的乘積。

表3 試劑A、B檢測結(jié)果平均Ct值均值及CV

注：-為無數(shù)據(jù)。

2.3不同試劑檢測結(jié)果平均循環(huán)閾值(Ct)值及Ct值變異系數(shù)(CV) 本次完成考核的實驗室中，22家使用試劑A，4家使用試劑B，其余實驗室均只涉及一個廠家試劑，故本次考核只對試劑A和試劑B進行統(tǒng)計分析。試劑A和試劑B的檢測結(jié)果Ct值均值及Ct值CV見表3。結(jié)果顯示,試劑A、B檢測結(jié)果的Ct值均值相差不大，但試劑A檢測結(jié)果的CV值波動較小，在9%～12%之間，而試劑B檢測結(jié)果的CV值波動較大，在6%～18%之間，由此可見，試劑A的批間重復(fù)性較試劑B要好。在弱陽性樣品202002和202006的檢測中，試劑B的重復(fù)性均較試劑A好。

3 討 論

近期在湖北省武漢市出現(xiàn)的COVID-19，有極強的傳染性，引起了全國乃至世界的廣泛關(guān)注[7-8]。確診COVID-19的金標準是SARS-CoV-2核酸檢測。

核酸檢測結(jié)果的準確性涉及患者疾病發(fā)展過程、標本采集、標本保存與運輸、樣品檢測等多過程。本次考核，只針對樣品檢測，包括核酸提取、擴增體系、人員操作、室內(nèi)質(zhì)控等因素，即檢驗中的質(zhì)量管理。本次考核所涉及的34家SARS-CoV-2核酸檢測實驗室，是由省級衛(wèi)生健康委員會指定，有5家醫(yī)療機構(gòu)實驗室通過了ISO15189認可，1家疾控實驗室通過了ISO17025認可。這些醫(yī)療機構(gòu)實驗室，包括第三方實驗室，經(jīng)過多年的實踐，在質(zhì)量管理方面均有豐富的經(jīng)驗，一些沒有通過認可的實驗室，基本也是參照相關(guān)質(zhì)量管理體系進行質(zhì)量管理。同時，對于國家或者省級臨床檢驗中心開展了室間質(zhì)評的項目，幾乎所有的實驗室都參加了相關(guān)項目的室間質(zhì)評，保障了檢驗質(zhì)量。

本次考核的考核品包括陰性、弱陽性和陽性樣品。陰性樣品為稀釋液，陽性樣品采用裝甲RNA技術(shù)，將3個目標RNA序列(含ORF 1ab、N和E基因)用噬菌體蛋白外殼加以包裹，其結(jié)構(gòu)類似于天然病毒，以還原真實的樣品，本文所用的陽性或弱陽性考核品具有蛋白外殼，因此可作為抑制質(zhì)控品，與臨床標本相似，可直接作為待測樣本進行檢測，全程模擬病毒裂解、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及擴增的整個過程，這是采用裸露的質(zhì)粒DNA或RNA片段作為質(zhì)控品所無法比擬的。且采用裝甲RNA技術(shù)制備的考核品具有穩(wěn)定、不易被RNA酶降解、無生物安全問題、無傳染危險性、可準確定量等優(yōu)點。

21家醫(yī)療機構(gòu)中，其中20家為三甲醫(yī)院，1家為三級醫(yī)院。參與的30家檢測實驗室，均建立了完整的質(zhì)量管理體系，嚴格按照操作規(guī)程和室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則進行實驗室檢測。所以在這次的SARS-CoV-2核酸檢測中，才能夠出現(xiàn)100%的符合率。

在回報的30家檢測實驗室中，用于考核樣品檢測的試劑一共來自6個廠家，并且主要集中在傳統(tǒng)的2家基因試劑廠家上，占87%左右，說明我國傳統(tǒng)試劑生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量是過硬的。本次完成考核的實驗室中，22家使用試劑A，4家使用試劑B，其余實驗室均只涉及一個廠家試劑，每家實驗室均完成了這10批考核品的檢測，所使用的6個廠家試劑中，除1家試劑的檢測位點為ORF 1ab、N和E基因外，其余5家檢測位點均為ORF 1ab和N基因，且各組試劑對各基因的檢出率均為100%。專家認為，理論上SARS-CoV-2的mRNA轉(zhuǎn)錄模式與SARS類似，細胞中SARS-CoV-2的mRNA是病毒基因組RNA的數(shù)倍，且在轉(zhuǎn)錄時會形成不同長度的mRNA片段，這些mRNA片段均含有N基因，而只有少數(shù)mRNA片段含有ORF 1ab基因，因此臨床樣本中N基因的拷貝數(shù)遠遠高于ORF 1ab，而目前的試劑盒主要檢測細胞內(nèi)的病毒mRNA，因此N基因的檢測陽性率要高于ORF 1ab基因；再者，N基因保守程度不及ORF 1ab基因，故少數(shù)樣本可能與其他類型冠狀病毒的核酸序列存在交叉而導致N基因擴增陽性而ORF 1ab基因陰性[9]。本次考核中，各試劑對ORF 1ab基因和N基因的檢出率均為100%，這可能與陽性樣品中這2個基因的水平相當及其穩(wěn)定性較臨床標本高有關(guān)。

本次考核發(fā)現(xiàn)，與試劑B相比，試劑A具有較好的批間重復(fù)性。而6種試劑的檢出率均為100%，說明目前臨床關(guān)注的SARS-CoV-2核酸檢出率低的問題，與試劑盒檢出率大小關(guān)系不大，但部分試劑的穩(wěn)定性較差，因而各廠家試劑盒檢測性能有待進一步優(yōu)化。臨床檢驗全面質(zhì)量管理，其中的分析前質(zhì)量管理極其重要，患者疾病發(fā)展過程、標本采集、標本保存與運輸?shù)龋瑢z測陽性率有著決定性作用。筆者認為，對于社會關(guān)注的SARS-CoV-2核酸檢測陽性率低的問題，主要是由患者疾病發(fā)展過程、標本采集、標本保存與運輸?shù)葐栴}引起。加強與臨床和疾控采樣人員的溝通和聯(lián)系，共同對分析前進行質(zhì)量管理，以保障檢驗質(zhì)量，其意義非常重要。

對于貴州省臨床檢驗中心組織的這次現(xiàn)場考核，由于時間緊，任務(wù)重，還存在許多不足之處，比如未對考核樣品的一致性和穩(wěn)定性進行驗證，對于考核品的定值是采用本實驗室儀器進行的，其準確性可能存在一定的誤差。各檢測實驗室對這次考核非常重視，有的實驗室進行了2次及以上的檢測，未能體現(xiàn)其真實檢測水平，也是造成全部符合的原因之一。盡管在研究中采取了裝甲RNA技術(shù)制備考核樣品，但是假病毒中只包含了ORF 1ab、N和E 3個目標RNA序列，與真實病毒有著很大的差別，相對于真實病毒的核酸提取要容易得多。由于考核樣品是無感染性的，在檢測過程中沒有要求滅活，所以對于臨床標本檢測過程中的滅活過程，是否會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，還有待驗證。