基于未修飾的絲網印刷電極測定辣椒堿

李韋琴，江豐，曹偉偉，吳婷，潘思軼，徐曉云

(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070)

辣椒堿是一種含酚羥基的生物堿，分子式為C18H27O3N，化學名為反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺，又名辣椒素或辣椒辣素，是辣椒中重要的辣椒素類物質，約占辣椒素類物質的69%[1-2]，是衡量辣椒品質的重要指標。具有抗氧化、抗菌消炎、鎮痛止癢、促進脂肪代謝等多種生理活性[3-7]。

我國是辣椒生產、消費大國[8]，我國的辣椒品種及辣椒制品種類繁多。辣椒堿含量已成為評價辣椒品種及其加工品品質的重要指標，在辣椒品種的選育方面、食品行業和制藥工業上有重要地位[9]。尤其是辣味鹵制品鹵煮過程中，需及時檢測鹵汁中的辣椒堿含量，確保添加適量的辣椒使辣椒堿含量維持在較高的水平，這就迫切需要建立辣椒堿的快速檢測方法。

目前，辣椒堿的測定方法主要有感官測定法、比色法、液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)、氣相色譜質譜法(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)、酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和電化學(electrochemistry)等方法[10-15]。但是感官測定法受主觀和客觀因素影響較大；比色法操作繁瑣、費時費事、靈敏度和準確度低；HPLC是最常用的檢測方法，但所用儀器價格昂貴、成本高、步驟繁瑣；酶聯免疫法和質譜法同樣存在檢測成本高、周期時間長的問題，無法滿足經濟薄弱的中小型企業需求。而電化學的方法具有操作簡單、檢測效率高、穩定性好等優點[16]。目前關于印刷電極測定辣椒堿的報道大都是將印刷電極進行修飾，如已經被報道的氨基功能化碳微球修飾的印刷電極[17]及聚(4-苯乙烯磺酸鈉)功能化石墨修飾絲網印刷電極(screen-printed electrode，SPE)[18]，但成本高、步驟繁瑣。因此，制備價格低廉、靈敏度高、穩定的未修飾印刷電極在辣椒堿的測定上具有顯著的優勢。

本研究建立了一種未修飾的印刷電極測定辣椒堿的方法，與HPLC相比，具有方便快速、成本低、檢測限低的優點。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

貴州辣椒3批(分別記為A、B、C)、重慶辣椒2批(分別記為A、B)、湖北辣椒2批(分別記為A、B)、四川辣椒、河南辣椒、福建辣椒各1批，由周黑鴨國際控股有限公司提供，共10個批次的干辣椒試樣。

辣椒堿(純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；四氫呋喃、無水乙醇、NaOH、硼酸、H3PO4、乙酸、KOH、醋酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、HCl均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇(色譜級)，賽默飛世爾公司。

CHI850D型電化學工作站，上海辰華儀器有限公司；Waters 2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司；PHS-3電子精密pH計，上海雷磁儀器廠；絲網印刷電極(三電極系統組成：碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，碳電極為輔助電極)，武漢市農業科學院環境與安全研究所；DL150-2氮吹儀，杭州佑寧儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預處理及辣椒堿的提取

樣品的預處理：將辣椒樣品除蒂除雜后，在60 ℃干燥箱中烘干，粉碎過100目篩，稱量、裝瓶備用。

干辣椒辣椒堿的提取：參考GB/T 21266—2007并稍作改動[19]，稱取2.50 g烘干的辣椒樣品于100 mL燒杯中，加入V(甲醇)∶V(四氫呋喃)=1∶1混合溶劑25 mL，保鮮膜封口，50 ℃超聲提取30 min，過濾，濾渣重復提取2次，合并濾液，60 ℃條件下經真空旋轉蒸發儀濃縮，冷卻后定容至50 mL，取1 mL濾液用氮氣吹干，加體積分數10%乙醇溶解，4 ℃儲存，備用。

辣椒鹵水的制備：取烘干的辣椒2.60 g，添加蒸餾水186.00 g、玉米油14.00 g，130 ℃加熱20 min，得到辣椒鹵水。

辣椒鹵水辣椒堿的提取：將鹵水倒入分液漏斗，取上層油相，降至室溫后參考文獻[20]提取辣椒堿，取1 mL提取液經氮氣吹干后，加體積分數10%乙醇溶解，4 ℃儲存，備用。

1.2.2 電化學測定條件的優化

1.2.2.1 乙醇體積分數的優化

選擇KCl濃度為40 mmol/L，電解質溶液體系為Britton-Robison(BR)溶液，pH值為2，采用循環伏安(cyclic voltammetry，CV)法研究5%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇體積分數分別對未修飾印刷電極測定辣椒堿的影響。

1.2.2.2 電解質溶液體系的優化

1.2.2.3 pH的優化

選擇KCl濃度為40 mmol/L，電解質溶液體系為BR溶液，辣椒堿溶液中乙醇體積分數為10%，采用CV法研究pH值分別為1、2、3、4、5、6對未修飾印刷電極測定辣椒堿的影響。

1.2.2.4 KCl濃度的優化

選擇電解質溶液體系為BR溶液，pH值為1，辣椒堿溶液中乙醇體積分數為10%，采用CV法研究KCl濃度分別為10、20、40、80、160 mmol/L對未修飾印刷電極測定辣椒堿的影響。

1.2.3 電化學方法學考察

1.2.3.1 標準曲線和檢測限的測定

分別選取濃度為0.80、1.68、3.36、6.73、13.46、26.93、53.86、107.72 μmol/L辣椒堿標液，采用方波伏安法測定辣椒堿氧化峰電流值，以辣椒堿的濃度為橫坐標，以峰電流值為縱坐標繪制辣椒堿的標準曲線，根據標準曲線的斜率(k)和空白樣測定的標準偏差(standard deviation, SD)，求得其檢測限(LOD = 3SD/k)。

1.2.3.2 方法精密度和穩定性的測定

監督是一項要求極高的系統工程，影響監督效力的因素本身也是綜合且復雜的。盡管目前我國的紀檢監察派駐制度成效顯著，然而其不足之處也十分明顯。筆者認為可以通過以下途徑進行改革與探索，以期盡快解決影響我國紀檢監察派駐功能發揮的問題。

選擇濃度為107.72 μmol/L的辣椒堿溶液平行測定5次，計算平行測定值的相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)來表示精密度大小；選擇濃度為107.72 μmol/L的辣椒堿溶液分別在0、12、24、48、60 h測定其峰電流值，計算不同時間測定值的RSD來表示穩定性大小。

1.2.3.3 方法加標回收率的測定

取已知辣椒堿含量的樣品9份，分別加入等體積不同濃度的辣椒堿標液，得到加標濃度為10.00、20.00、40.00 μmol/L的加標樣品，各濃度下的加標回收率按公式(1)計算：

(1)

1.2.4 HPLC測定辣椒堿

色譜柱為TOSOH TSKgel ODS-100V (5 μm，250 mm×4.6 mm)；柱溫25 ℃；梯度洗脫條件：V(水)∶V(乙腈)=50∶50，等度洗脫30 min；流速1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進樣量40 μL。

分別配制質量濃度為25、50、100、150、200、250 μg/mL的辣椒堿溶液，現配現用，采用HPLC對各濃度標準溶液進行測定。以辣椒堿的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 乙醇體積分數的優化

不同乙醇體積分數對CV法測定辣椒堿的影響如圖1所示。辣椒堿溶液中乙醇體積分數為5%時，辣椒堿氧化峰電流最高，隨著乙醇體積分數的增加，辣椒堿的氧化峰電流值減小(圖1-a)，這與S?PSTAD等[21]的研究結果一致，因為乙醇會影響辣椒堿的電荷轉移，抑制辣椒堿的氧化還原反應。但辣椒堿作為脂溶性化合物，易溶于有機溶劑，過低的乙醇體積分數會導致辣椒堿的溶解度降低。因此，選擇10%乙醇體積分數作為適宜的測定條件。

a-不同乙醇體積分數下辣椒堿的CV曲線;b-不同乙醇體積分數下辣椒堿的的氧化峰電流值圖1 乙醇體積分數對CV法測定辣椒堿的影響Fig.1 The influence of ethanol concentration on measuringcapsaicin with CV

2.2 電解質溶液體系的優化

不同電解質溶液對CV法測定辣椒堿的影響如圖2所示。

由圖2可知，BR、CH3COOH-CH3COONa、NaH2PO4- Na2HPO4三種電解質溶液會影響辣椒堿的氧化峰電位值，BR的氧化峰電位值最小(圖2-a)，但3種電解質溶液對辣椒堿的氧化峰電流值沒有顯著性影響(圖2-b)，3種電解質溶液也在多種電極測定辣椒堿電化學方法中使用。因此，BR、CH3COOH-CH3COONa和NaH2PO4-Na2HPO4電解質溶液均可用于此電極測定辣椒堿。

2.3 pH的優化

不同pH對CV法測定辣椒堿的影響如圖3所示。由圖3可知，pH值為1時，辣椒堿氧化峰電位(圖3-a)和電流值(圖3-b)最大。隨著pH值從1升高至4，辣椒堿的氧化峰電位值和電流值逐漸降低，這是因為pH的升高導致辣椒素分子中酚醛結構的部分去質子化，這與pH對碳微球修飾絲網印刷電極[17]及鈀修飾的還原型氧化石墨烯電極[2]測定辣椒堿的電流值影響一致。隨著pH值由4升高至6，氧化峰電流值不變，但氧化峰電位繼續左移。考慮到靈敏度，選擇pH 1作為最佳pH條件。

a-不同緩沖溶液下辣椒堿的CV曲線；b-不同緩沖溶液下辣椒堿的氧化峰電流值圖2 緩沖溶液對CV法測定辣椒堿的影響Fig.2 The influence of buffer systems on measuringcapsaicin with CV

a-不同pH下辣椒堿的CV曲線;b-不同pH下辣椒堿的氧化峰電流值圖3 pH對CV法測定辣椒堿的影響Fig.3 The influence of pH values on measuring capsaicinwith CV

2.4 KCl濃度的優化

不同KCl濃度對CV法測定辣椒堿的影響如圖4所示。KCl的濃度對辣椒堿的氧化峰電位值沒有顯著性影響(圖4-a)，由圖4-b可知，當KCl 濃度達到80 mmol/L時，辣椒堿氧化峰電流值趨于穩定， 含80 mmol/L KCl的辣椒堿溶液的氧化峰電流值顯著高于含10、20、40 mmol/L KCl的辣椒堿溶液的氧化峰電流值，與含160 mmol/L KCl的辣椒堿溶液沒有顯著性差異，表明80和160 mmol/L的KCl濃度下電極反應容易發生。因此，選取KCl濃度為80 mmol/L即可滿足要求。

a-不同KCl濃度下辣椒堿的CV曲線;b-不同KCl濃度下辣椒堿的氧化峰電流值圖4 KCl濃度對CV法測定辣椒堿的影響Fig.4 The influence of KCl concentration on measuringcapsaicin with CV

2.5 標準曲線和檢測限的測定

如圖5所示，在優化的檢測條件下，隨著辣椒堿濃度的增加，辣椒堿氧化峰電流顯著增加。辣椒堿響應電流值Y與其辣椒堿濃度X在0.80～107.72 μmol/L范圍內呈良好線性關系，線性方程為Y=0.063 5X+0.385 8，R2為0.981 6。該線性范圍比報道的氧化釔(Y2O3)納米粒子修飾的石墨糊電極(1～80 μmol/L)[22]以及Ag/Ag2O納米粒子和還原型氧化石墨烯復合修飾的印刷電極(1～60 μmol/L)[23]測定辣椒堿的線性范圍寬。

根據標準曲線的斜率(k)和空白樣測定的標準偏差(SD)，得到該未修飾印刷電極測定辣椒堿的檢出限為0.13 μmol/L，該檢測限低于本文HPLC測定的辣椒堿檢測限(24.56 μmol/L)，且低于已報道的多壁碳納米管納米金粒子復合材料修飾玻碳電極[15]和碳納米管修飾石墨電極[24]測定辣椒堿的檢測限(0.89和0.31 μmol/L)。

圖5 辣椒素的標準曲線圖Fig.5 The calibration plot of capsaicin

2.6 方法精密度和穩定性的測定

由表1可知，平行測定的同一辣椒堿標準液(107.72 μmol/L)氧化峰電流值大小的RSD為2.10%，表明精密度好。由表2可知，在0～60 h內測定同一辣椒堿標準液的氧化峰電流值大小的RSD為6.53%，具有較好的穩定性。以上結果表明該未修飾印刷電極測定辣椒堿具有良好的精密度和穩定性。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision test

表2 穩定性實驗結果Table 2 Results of stability test

2.7 方法加標回收率的測定

從表3可知，10、20、40 μmol/L三個不同濃度辣椒堿的樣品的加標回收率在91.87%～100.86%之間。結果表明，此未修飾印刷電極測定辣椒堿的結果準確可靠，可以應用于實際辣椒樣品中辣椒堿的測定。

表3 辣椒堿的加標回收率Table 3 Results of the recovery analysis of capsaicin inthe extract of pepper samples

2.8 電化學和液相色譜測定辣椒堿的結果比較

5種不同產地的干辣椒及5種辣椒鹵水中辣椒堿的電化學和液相色譜測定結果如表4和表5所示。由表4、表5可知，所有干辣椒及辣椒鹵水中辣椒堿的電化學測定結果與HPLC測定結果基本一致，2種方法測定干辣椒及辣椒鹵水中辣椒堿的RSD較小，分別在0.41%～6.78%、0.80%～8.80%之間，這表明該電化學檢測方法準確、可靠，可以作為替代HPLC的方法，應用于辣椒及其辣椒制品辣椒堿的測定。

表4 電化學和液相色譜測定干辣椒辣椒堿的結果比較Table 4 Comparison of capsaicin content in dried pepperdetermined by electrochemistry and HPLC

表5 電化學和液相色譜測定鹵水辣椒堿的結果比較Table 5 Comparison of capsaicin content in bitterndetermined by electrochemistry and HPLC

3 結論

本實驗對未修飾的印刷電極應用于辣椒堿的測定條件進行優化，建立了此印刷電極測定辣椒堿的電化學方法。此印刷電極測定辣椒堿的適宜條件為：乙醇體積分數10%、KCl濃度80 mmol/L、pH 1，3種電解質溶液BR、CH3COOH-CH3COONa、NaH2PO4-Na2HPO4溶液均適宜。該方法在0.80～107.72 μmol/L范圍內辣椒堿氧化峰電流值與辣椒堿的濃度呈良好線性關系，檢出限為0.13 μmol/L，具有較好的精密度、穩定性及加標回收率。此外，該方法可代替傳統的HPLC法測定辣椒堿，具有操作簡單、成本低、檢測效率高等優點，為辣椒堿的快速、準確測定方法提供了借鑒。