發酵辣椒中生物胺含量及其品質分析

吳訓忠，支菁蕾，闞建全，武運，杜木英*

1(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715) 2(中匈食品科學合作研究中心，重慶，400715) 3(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊，830052)

食品在發酵過程中由于微生物作用不可避免地產生生物胺。生物胺是一類低分子質量含氮的有機活性物質，通常分為單胺和多胺兩大類，廣泛存在于多種食物之中，特別是發酵食品。生物胺按來源不同，可分為兩種合成途徑：一種是內源性生物胺，由醛或酮的轉氨作用生成屬于脂肪族的生物胺[1]；二是由游離氨基酸脫羧產生，即游離氨基酸在微生物的氨基酸脫羧酶作用下脫羧生成相應生物胺,此途徑需滿足3個基本條件：氨基酸(前體物質)；產氨基酸脫羧酶的微生物及適宜該微生物的環境條件。同時生物胺也是生物體內重要的活性成分，是激素、生物堿、核酸等物質合成的前體物質，適量的生物胺可以促進人體生長、增強代謝活力、清除自由基和增強腸道系統免疫功能[2-3]，但過量的生物胺則會引起人體不良反應，如頭痛、嘔吐、心悸、呼吸紊亂及血壓變化等[4]。組胺在生物胺中毒性最大，過量會引發頭痛、消化障礙、血壓異常，甚至有一定神經性毒性[5]。酪胺毒性次之，過量也會引起頭痛和高血壓等反應。尸胺和腐胺本身毒性較小，但這兩者能抑制組胺和酪胺相關代謝酶的活性而進一步增加組胺和酪胺的含量，從而增強人體的不適癥狀[6]，并且這2種生物胺能夠與亞硝酸鹽反應產生亞硝胺[7]，具有潛在的致癌性。另外，高濃度的生物胺會嚴重影響食品風味甚至改變其成分[8]。因此，監控食品中的生物胺水平，控制食品中生物胺的形成，有助于提高和改善食品的質量和安全性。生物胺目前尚未有統一的限量標準，主要是因為：1)種類及毒性不一；2)生物胺可以在人體內相互轉化[2]；3)毒性受其他生物胺、胺氧化酶等影響；4)不同人體對生物胺敏感性不同。對于組胺，美國規定水產品中不得超過50 mg/kg；歐盟規定不得超過100 mg/kg；我國特別規定鮐魚中生物胺不得超過1 000 mg/kg，其他魚類不得超過300 mg/kg。

發酵辣椒是我國特別是西南一帶較為流行的日常調味品，以新鮮辣椒為主要原料，添加食鹽、酒、生姜、大蒜等調味輔料，采用傳統工藝經厭氧發酵制成，保留了新鮮辣椒的形態、辣味，又有特有的發酵風味和香氣，具有增味、增香、開胃、增進食欲等作用。我國常見的傳統發酵辣椒制品有糟辣椒、剁椒、泡椒、醬辣椒、鲊辣椒5種。

目前關于生物胺的研究，多集中于我國特有的發酵食品，如豆瓣醬[9]、豆豉[10]、黃酒[11]、肉類產品[12]等。在肉類、豆豉、醬油等原材料蛋白質含量較高且發酵旺盛的食品中生物胺含量較高，甚至可以達到1 898 mg/kg。同時在生物胺控制方面部分研究也取得了相應研究成果[13-14]，主要針對生物胺形成的途徑進行控制。

為更加全面地評估發酵辣椒的綜合品質，本研究采集云南、貴州、四川等地的各種發酵辣椒，采用柱前衍生-高效液相色譜法檢測了5種發酵辣椒共20個樣品中的生物胺含量，檢測分析了可能與生物胺含量相關的還原糖、總酸及氨基酸態氮含量理化參數，分析發酵辣椒中不同含量生物胺存在的潛在原因。同時采用評分法進行感官評價，綜合以上評價發酵辣椒品質，以期為發酵辣椒中生物胺的安全及品質研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用發酵辣椒樣品編號見表我。各樣品于-18 ℃下保存。

表1 樣品編號表Table 1 Sample number

色胺(CAS：61-54-1，純度>98%)、腐胺(CAS：110-60-1，純度>98%)、尸胺(CAS：462-94-2，純度>98%)、2-苯乙胺(CAS：64-04-0，純度>97%)、苯甲酰氯(純度>98%)，東京化成工業株式會社；亞精胺(CAS：124-20-9，純度>98%)、精胺(CAS：71-44-3，純度≥98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，HCl、NaOH、NaCl、乙醚，分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；MX-F微型旋渦振蕩器，上海瀘西分析儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；PGC-21D可調式氮吹儀，北京中諾遠東公司；VS-35S可調勻漿機，無錫沃信儀器有限公司；HZ-9211K恒溫振蕩器，太倉市科技器材廠；TG16可調高速離心機，長沙英泰儀器有限公司；pHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-1240紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 生物胺標準儲備液的制備

準確稱取生物胺標準品各10 mg，以0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制標準儲備溶液，使其終質量濃度為1 mg/L，于4 ℃冰箱儲存。

取上述各標準品儲備液，仍以0.1 mol/L HCl溶液為稀釋溶液配制成終質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg/L單標準品使用液及混合標準品使用液。

1.3.1.2 生物胺的柱前衍生

吸取2 mL上述各濃度的生物胺混合標準溶液，分別加入2 mol/L NaOH溶液1 mL和苯甲酰氯10 μL，旋渦振蕩混勻后，在30 ℃下避光反應40 min，并每隔10 min振蕩混勻1次。完成后加入飽和NaCl溶液2 mL。然后加入無水乙醚3 mL進行萃取，1 200 r/min離心10 min后小心移取乙醚層于10 mL離心管中，再重復提取1次，合并乙醚層。用氮吹儀在35 ℃下吹干，最后用1 mL甲醇(色譜純)溶解，0.45 μm過膜后進行檢測分析。

1.3.1.3 樣品衍生化

準確稱量辣椒樣品10 g于離心管中，加入20.00 mL 0.1 mol/L HCl溶液，使用勻漿機得到勻漿，振蕩提取10 min后靜置5 min，8 000 r/min離心15 min，取上清液于50 mL容量瓶；向沉淀中再次加入20.00 mL 0.1 mol/L HCl溶液按上述步驟重復提取，合并上清液。0.1 mol/L HCl定容至50 mL，混勻取2 mL于離心管中，加入2 mol/L NaOH溶液1 mL，10 μL苯甲酰氯靜置30 s，于30 ℃避光加熱40 min；繼續加入2 mL飽和NaCl溶液、3 mL乙醚，1 200 r/min離心10 min，取上層液體置于離心管中。下層液體再次加入3 mL乙醚，1 200 r/min離心10 min，合并上層液體。35 ℃氮吹儀吹干，1 mL甲醇溶解，0.45 μm過濾膜備用。

1.3.2 生物胺測定

色譜柱為Thermo-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為超純水，流動相B為甲醇。參考劉敏等[16]的方法采用梯度洗脫(表2)，為降低系統壓力保證設備安全運行，流速設為0.6 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.3 理化指標的測定

1.3.3.1 還原糖的測定

以3，5-二硝基水楊酸法進行測定，檢測波長為550 nm，DNS顯色劑用量為2.0 mL，沸水浴顯色時間為5 min。

1.3.3.2 總酸的測定

取25.00～50.00 g勻漿，使之含0.035～0.070 g酸，置于250 mL三角瓶中。加入40～50 mL水及0.2 mL體積分數1%酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH標準溶液滴定，至微紅色且30 s不褪色。空白試驗以水代替。樣品中的總酸含量以質量分數(X)計，按公式(1)計算：

(1)

式中：c(NaOH)，NaOH標準滴定溶液濃度，mol/L；V1，滴定試液時消耗NaOH標準滴定溶液的體積，mL；V2，空白試驗時消耗NaOH標準滴定溶液的體積，mL；K，換算系數，蘋果酸(0.067),乙酸(0.060),酒石酸(0.075),檸檬酸(0.070 0)(含1分子結晶水)，乳酸(0.090),HCl(0.036),H3PO4(0.049)；n，試液稀釋倍數；m，試樣的質量，g。

1.3.3.3 氨基酸態氮的測定

將樣品攪拌均勻后放入研缽，在10 min內迅速研磨至無肉眼可見顆粒，裝入磨口瓶中備用。用已知質量的稱量瓶稱取攪拌均勻的樣品5.0 g，用50 mL 80 ℃左右的蒸餾水分數次洗入100 mL燒杯中，冷卻后轉入100 mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混勻后過濾。吸取濾液10.0 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動磁力攪拌器，用NaOH標準溶液[c(NaOH)=0.050 mol/L]滴定至酸度計指示pH值為8.2。加入10.0 mL甲醛溶液，混勻。再用NaOH標準滴定溶液繼續滴定至pH值為9.2。同時做試劑空白試驗，取 80 mL水，先用NaOH標準溶液調節至pH值為8.2，再加入10.0 mL甲醛溶液，用NaOH標準滴定溶液滴定至pH值為9.2。樣品中的氨基酸態氮的含量(X)按公式(2)計算：

(2)

式中：X，試樣中氨基酸態氮的含量，g/100 g；V1，測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗NaOH標準滴定溶液的體積，mL；V2，試劑空白實驗加入甲醛后消耗NaOH標準滴定溶液的體積，mL；c(NaOH)，NaOH標準滴定溶液的濃度，mol/L；0.014，與1.00 mL NaOH標準滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當的氮質量，g；m，試樣質量，g；V3，試樣稀釋液的取用量，mL；V4，試樣稀釋液的定容體積，mL；100，單位換算系數；計算結果保留2位有效數字。

1.3.4 感官分析評價

參考劉昕等[15]的質量評價指標分析修改后進行感官評定，總分60分，評定指標為色澤、香氣和口感，計算平均分作為發酵辣椒制品的最終結果。感官評分表如表3所示。

表3 感官分析評分表Table 3 Sensory analysis score sheet

1.4 數據分析

所有數據均使用SPSS Statistic 20.0軟件進行數據的線性回歸分析，結果采用Origin 2018軟件進行統計和繪圖。

2 結果與分析

2.1 生物胺檢測

2.1.1 生物胺標準品曲線回歸方程

生物胺標準品液相色譜圖見圖1。結果顯示該方法可使試樣中的生物胺在25 min內有效分離，且峰形良好。

圖1 生物胺標準品液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of biogenic amine standards

通過高效液相檢測單種生物胺標準品可得到8種生物胺的保留時間，梯度濃度檢測得到各生物胺曲線回歸方程，由表4可知其相關性系數R2均大于0.997，說明峰面積與生物胺含量之間存在顯著的線性相關性。連續對40 μg/L混合標準品進樣6次，RSD在0.05%～6.27%之間，以信噪比(S/N)>3作為檢出限的判斷標準，以信噪比(S/N)>10作為定量限的判斷標準，樣品含量<定量限標準不計算，酪胺的檢測限最高為0.336 mg/kg，色胺最低為0.013 mg/kg。

表4 標準曲線的回歸方程Table 4 Result of regression equations

2.1.2 樣品中的生物胺含量及分析

各樣品中的生物胺含量如表5，所有樣品生物胺總量在3.281～398.381 mg/kg，跨度范圍較大，說明不同種類發酵辣椒生物胺總量差別較大。所有樣品中均含有酪胺，其中3號、4號樣品中含量較高； 5號、 13號樣品中色胺含量較高。由圖2可見，糟辣椒樣品中酪胺的含量明顯高于其他種類發酵辣椒，泡椒樣品中的酪胺含量均較低，同時11個泡椒樣品中有8個樣品生物胺含量均較低，此現象可能與糟辣椒和泡椒的制作工藝有關，糟辣椒多是取鮮紅辣椒剁細后加入鹽、酸、姜等調味料拌勻后封壇發酵，傳統泡椒多是加入姜、蒜等采用直接酸漬或鹽漬制成，發酵環境鹽度及酸度高于糟辣椒，抑制了微生物的生長繁殖，從而抑制了生物胺的形成。大部分樣品中酪胺、腐胺、尸胺、組胺占生物胺總量的絕大部分，5號樣品、8號樣品、7號樣品、10號樣品、13號樣品中這4種生物胺含量占比較少，均是色胺或2-苯乙胺占總量的絕大部分，樣品中高濃度色胺的原因可能是在原料中本身含有較高濃度的色氨酸。

所有樣品都檢測出的酪胺，是目前認為毒性僅次于組胺的生物胺。適量的酪胺具有明顯的抗氧化作用[16]，也對增強心率及血糖血壓的升高有作用；但過量的酪胺會引起頭痛、高血壓等不良反應。另外，尸胺和腐胺可以抑制與其代謝相關酶活性從而增加酪胺的數量，進一步加強人體應激反應。目前世界各國及組織對于生物胺的限量沒有一個較為統一的標準，而且大多是針對毒性較強的組胺，對于酪胺僅歐盟規定酪胺在食品中的限量為100 mg/kg[17]。

表5 發酵辣椒中的生物胺的檢測結果Table 5 Determination of biogenic amines in fermented pepper

注：標注ND表示未檢出；不同字母標注表示顯著性差異(下同)

圖2 各發酵辣椒酪胺含量Fig.2 The content of tyramine in fermented pepper注：不同小寫字母表示顯著性差異(下同)

圖3 發酵辣椒生物胺總含量Fig.3 Total bioamine content in fermented pepper

作為一般日常生活中食用的調味品，發酵辣椒中的生物胺總量少，且毒性較強的組胺含量較低，以普通食物中的生物胺限定標準作為參照，每日從發酵辣椒中攝入的生物胺含量都低于限定標準，所以一般食用發酵辣椒不會引起不良反應。

2.2 理化指標

樣品理化指標如表6所示，發酵辣椒樣品中的還原糖含量在0.06%～10.21%之間，泡椒樣品中的還原糖含量幾乎都在1.00%以下，南昌糟辣椒還原糖含量甚至達10.21%。在辣椒發酵過程中，由于乳酸菌及其他雜菌的生長繁殖，會導致其中的葡萄糖含量迅速下降，到發酵后期由于酸含量的持續上升，絕大多數雜菌受到抑制，還原糖含量下降緩慢并趨于穩定。本次大部分樣品中還原糖含量較低應是受蔬菜原料本身的影響，也有可能是因為發酵時間較長，發酵較為完全。其中還原糖含量較高的樣品是由于原料中手動加入了糖進行提味增鮮或發酵程度較低。

糟辣椒總酸含量在0.18～1.85 g/100 g，較其他發酵辣椒有特殊明顯的酸甜口味，但其酸味與總酸含量之間未發現明顯的相關性。發酵辣椒樣品中的氨基酸態氮含量在0.06～0.45 g/100 g，氨基酸態氮含量較高的發酵辣椒品種為醬辣椒，可能與其完全不同于其他發酵辣椒的制作工藝及原料的多樣性有關。

表6 發酵辣椒理化指標檢測結果Table 6 Physical and chemical indicators test resultsof fermented pepper

2.3 感官評價

從表7可知， 2號、6號、12號、14號、18號樣品的得分均較高。得分較高的發酵辣椒基本保留了辣椒本身的紅色，具有較好的色澤，且具有獨有的醇香，容易激發人的食欲，易嚼，具有適當的酸甜及辣度。各樣品的評分均滿足人們的日常口味，出現的評分差異可能是在制作的過程中原料選擇、發酵條件、發酵時間等的不同所造成的。由于7號河池醬辣椒及8號昆明醬辣子產品的工藝及主要原材料與其他辣椒制品相差較大，不納入本感官評價范圍。

選取得分較高的2號、6號、12號、14號、18樣品得分進行雷達圖分析。由圖4可知，5個樣品在色澤和香氣得分存在較大的差異，2號樣品色澤及6號的香氣得分明顯較高。口感方面，5個樣品的得分差異較小，說明得分較高的發酵辣椒品種在辣味、微酸味、咸度及咀嚼難易程度等方面相似的。相比色澤和香氣方面，口感得分較低，說明在口感方面仍有較大提升空間，以得到感官品質更好的產品。

由圖4可知，5個樣品在色澤和香氣得分存在較大的差異，2號樣品色澤及6號的香氣得分明顯較高。口感方面，5個樣品的得分差異較小，說明得分較高的發酵辣椒品種在辣味、微酸味、咸度及咀嚼難易程度等方面相似的。相比色澤和香氣方面，口感得分較低，說明在口感方面仍有較大提升空間。

表7 感官評分結果Table 7 Sensory score results

圖4 感官分析雷達圖Fig.4 The radar map of sensory analysis

3 結論與討論

本文采用HPLC苯甲酰氯柱前衍生梯度洗脫測定發酵辣椒中的8種生物胺，梯度洗脫方法能使生物胺在25 min內達到完全分離。測定結果顯示，樣品生物胺總量在3.281～398.831 mg/kg。作為一種日常生活中食用的調味品，生物胺總量少，且毒性較強的組胺含量較低，以普通食物中的生物胺限定標準作為參照，每日從發酵辣椒中攝入的生物胺含量都低于限定標準，安全性良好。

不同種類發酵辣椒生物胺總量存在顯著性差異，所有樣品中均含有酪胺，糟辣椒的酪胺含量明顯高于其他種類發酵辣椒，大部分泡椒的生物胺含量均較低。本研究發現，大多數樣品中酪胺、腐胺、尸胺、組胺含量占總量絕大部分，但有5個樣品中色胺或2-苯乙胺含量占絕大部分。譚李紅等[18]的研究均發現乳酸菌混合發酵在適宜條件下能夠抑制色胺的積累；韋宗卉等[19]研究發現乳酸菌發酵可降低辣椒醬中色胺和腐胺的含量，并推測色胺含量較高的產品可能是添加了生物胺含量較高的水產調味品。KALAC等[20-21]研究泡菜在儲藏過程中的生物胺變化，發現發酵泡菜中的微生物產生了大量的生物胺，尤其是腐胺及酪胺含量最高，歷經4～6個月貯藏甚至可達到200～300 mg/kg，但未檢測到組胺及色胺；邢茜等[22]檢測了市售泡菜中8種生物胺的含量，生物胺總量在39.38～628.82 mg/kg，除一個樣品中未檢測到色胺外，其余產品均含有8種生物胺，與本文結果有一定差異，原因可能是受原料本身及發酵程度的影響。生物胺的產生是多個因素共同影響的結果，發酵的溫度、pH、鹽度、原輔料、微生物、發酵時間等都會影響其濃度的高低。因此未來需進一步對發酵辣椒的生產工藝進行標準化，采取有效措施確保產品的安全及質量。

品質方面，還原糖、總酸、氨基酸態氮含量在各個樣品間均有一定差異，可能與制作原料品種本身有關。研究表明，生物胺的產生與一些理化指標有一定的相關性，本研究中還原糖、總酸、氨基酸態氮含量與生物胺含量之間未發現較強相關性。其中氨基酸態氮提供了生物胺形成的前體，但高氨基酸也不一定總是導致高生物胺含量，LORENZO等[23]在葡萄酒中外加組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，發現酒中的生物胺含量比未外加氨基酸的樣品低。目前研究認為氨基酸態氮之間可能存在一定聯系，尚待進一步研究。