microRNA- 29a- 3p對白介素- 22誘導的HaCaT細胞增殖的影響研究

李璟蓉 思 遠 趙 瑞 吳 江 方銳華

廣州市第一人民醫院皮膚科，華南理工大學附屬第二醫院皮膚科 (廣州 510180)

銀屑病是由多種因素作用引起的慢性鱗屑性皮膚病，具有病程遷延不愈和容易反復發作的特點，嚴重影響病人及其家屬的生活質量[1]。目前，銀屑病的發病機制尚不明確，但越來越多的研究表明銀屑病屬于免疫介導的多基因遺傳性皮膚病[1]。銀屑病以角質形成細胞過度異常增生為主要特征[2]。研究發現，可介導免疫調節的炎癥性因子白介素22(IL- 22)可以誘發人表皮角質形成細胞的增殖，抑制其凋亡，從而促進銀屑病的發生和發展[3- 4]。因此，探尋可以有效抑制IL- 22作用的分子機制將有助于進一步揭示銀屑病的發病機制，為銀屑病治療靶向藥物的研發提供新的分子靶點。

microRNAs (miRNAs)是一類長度約為21～23個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[5]。近年來，miRNAs在銀屑病發生和發展中的重要作用逐漸被揭示[6]。血清miR- 29a- 3p(也稱為miR- 29a)在自身免疫性疾病如硬皮病和類風濕性關節炎病人的血清中顯著降低，且miR- 29a- 3p通過抑制STAT3抑制類風濕性關節炎成纖維細胞樣滑膜細胞的增殖和誘導細胞凋亡[7- 8]。鑒于miR- 29a- 3p在自身免疫性疾病中的重要作用，我們推測miR- 29a- 3p可能在調控銀屑病的發生發展方面也發揮重要的作用。因此，本文將研究miR- 29a- 3p對IL- 22誘導的HaCaT細胞增殖及凋亡的影響，初步探討其在銀屑病發生發展中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

人永生化表皮細胞HaCaT來自上海中國科學院上海細胞庫；Minimum Essential Medium培養基和胎牛血清產自美國Hyclone；IL- 22產自美國PeproTech；CCK8試劑盒產自日本同仁化學研究所；miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit、SanPrep Column microRNA Extraction Kit和MicroRNAs qPCR Kit (SYBR Green Method)產自上海生工；miR- 29a- 3p mimic合成自上海吉瑪；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit產自美國BD Biosciences；Lipofectamine 2000產自美國invitrogen；細胞周期試劑盒產自上海碧云天。

1.2 細胞培養及分組

HaCaT細胞的培養基為Minimum Essential Medium加10%胎牛血清，置于條件為37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養。擴大培養后，使用不同濃度的IL- 22(0 μg/L，25 μg/L，50 μg/L，100 μg/L)處理細胞24 h和48 h和72 h，CCK8檢測細胞的活力。根據CCK8結果選擇50 μg/L和100 μg/L的IL- 22的處理HaCaT細胞24 h，收集細胞熒光定量PCR檢測miR- 29a- 3p的表達量。根據熒光定量PCR的結果，選擇50 μg/L作為后續實驗IL- 22的處理濃度，按照以下條件處理細胞，進行分組處理：

Cell組：按照轉染的步驟添加Lipofectamine 2000 到HaCaT培養基中，常規培養HaCaT細胞。

IL- 22組：按照轉染的步驟添加Lipofectamine 2000 到HaCaT培養基中，24 h后，使用50 μg/L IL- 22處理HaCaT細胞。

IL- 22+NC組：使用Lipofectamine 2000轉染陰性對照(NC)microRNA mimic，轉染24 h后，使用50 μg/L IL- 22處理HaCaT細胞。

IL- 22+ miR- 29a- 3p組：使用Lipofectamine 2000轉染miR- 29a- 3p mimic，預轉染24 h后，使用50 μg/L IL- 22處理HaCaT細胞。

1.3 細胞增殖實驗

將HaCaT細胞接種在96孔板中，按照以上分組條件處理細胞，分別于IL- 22處理后24、48、72 h，向每孔添加10 μL CCK8溶液，培養箱內孵育4 h。Varioskan Flash 全波長多功能酶標儀檢測450 nm處的吸光值。按照如下公式計算各組細胞的增值率：增殖率=(實驗組吸光值-對照組吸光值)/對照組吸光值×100%。

1.4 熒光定量PCR

將HaCaT細胞接種在6孔板中，按照以上分組條件處理細胞，于IL- 22處理后24 h，收集細胞。按照SanPrep Column microRNA Extraction Kit的說明書提取miRNAs。按照miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書進行加尾法的逆轉錄。根據MicroRNAs qPCR Kit (SYBR Green Method)的說明書配置PCR體系，置于BIO-rad CFX96熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應。miR- 29a- 3p正向引物序列如下：5′-CGGTAGCACCATCTGAAAT-CGGTTA-3′，miR- 29a- 3p反向引物及內參引物由試劑盒提供。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期

將HaCaT細胞接種在12孔板中，按照以上分組條件處理細胞，于IL- 22處理后48 h，收集細胞，按照FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit和細胞周期試劑盒的說明，處理細胞。ACEA NovoCyte流式細胞儀檢測。NovoExpress軟件分析各組細胞的凋亡和周期分步情況。

1.6 統計分析

2 結 果

2.1 IL- 22處理對miR- 29a- 3p表達的影響

見表1，與0 μg/L組相比，25 μg/L組、50 μg/L組和100 μg/L組HaCaT細胞的增殖率在24 h、48 h和72 h均出現升高(F值分別為33.27、36.19、52.29，均P<0.000 1)。

根據表1的結果，使用0 μg/L、50 μg/L和100 μg/L的IL- 22的處理HaCaT細胞，熒光定量PCR檢測miR- 29a- 3p的表達量，組間miR- 29a- 3p的表達量差異有統計學意義(F=129，P<0.000 1)。與0 μg/L組相比，miR- 29a- 3p在50 μg/L組和100 μg/L組HaCaT中的表達水平降低(均P=0.000 1)，分別降低83%和80%。因此，選擇50 μg/L作為后續實驗IL- 22的處理濃度。

表1 IL- 22處理24 h、48 h和72 h對HaCaT細胞增殖率的影響

*與0 μg/L組比較P<0.05。

2.2 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞增殖的影響

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間miR- 29a- 3p的表達量差異有統計學意義(F=12.31，P=0.002 3)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p組miR- 29a- 3p的表達量增加(P=0.002 8)，miR- 29a- 3p在HaCaT細胞中已成功過表達。

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間的增殖率在24 h、48 h和72 h差異有統計學意義(24 h：F=31.35，P<0.000 1；48 h：F=44.79，P<0.000 1；72 h：F=14.1，P=0.001 5)。統計結果見表2所示。與Cell組相比，IL- 22組的增殖率在24 h、48 h和72 h 均增高(P值分別為0.000 1、0.000 1、0.002 3)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+miR- 29a- 3p組的增殖率在24 h、48 h和72 h均降低(P值分別為0.002 1、0.001 6、0.023 1)。

表2 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞增殖的影響

*與Cell組比較P<0.05；#與IL- 22+NC組比較P<0.05。

2.3 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞凋亡的影響

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間HaCaT細胞總凋亡率差異有統計學意義(F=275.3，P<0.000 1)。見圖1。與Cell組相比，IL- 22組的細胞總凋亡率降低(11.17±0.75 vs 5.88±0.84，P=0.001 7)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p組的細胞總凋亡率增加(6.67±1.06 vs 30.55±1.86，P=0.000 1)。

2.4 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞周期的影響

Cell組、IL- 22組、IL- 22+NC組與IL- 22+ miR- 29a- 3p組各組間G1期和S期HaCaT細胞比例有差異(G1期：F=166.5，P<0.000 1；S期：F=116.6，P<0.000 1)，各組細胞G2期HaCaT細胞比例差異無統計學意義(F=1.574，P=0.269 9)。統計結果見表3，代表圖見圖2。與Cell組相比，IL- 22組G1期HaCaT細胞比例降低(P=0.000 1)，S期HaCaT細胞比例升高(P=0.000 1)。與IL- 22+NC組相比，IL- 22+ miR- 29a- 3p組G1期HaCaT細胞比例增加(P=0.000 1)，S期HaCaT細胞比例降低(P=0.000 1)。

圖1

表3 過表達miR- 29a- 3p對IL- 22處理的HaCaT細胞周期的影響

*與Cell組比較P<0.05；#與IL- 22+NC組比較P<0.05。

圖2 各組細胞周期代表圖

3 討 論

銀屑病是成人最常見的皮膚病，全世界1%～3%的人口受其影響。銀屑病最常見的類型是尋常型銀屑病，臨床表現為紅斑。銀屑病的主要特點之一是角質形成細胞的異常增殖和分化異常[2]。研究發現，細胞免疫尤其是T細胞激活及后繼的細胞因子釋放在銀屑病的發生發展中扮演了重要角色[9]。IL- 22是由Thl7和Th22等不同來源的T細胞產生的細胞炎性因子。研究發現，IL- 22參與抑制角質形成細胞的分化和異常增生，誘導銀屑病樣表皮改變[3- 4]。因此，阻斷IL- 22的作用將有可能改善銀屑病樣表皮改變，從而遏制銀屑病的發生發展。

近年來，表觀遺傳學因其在銀屑病發病機制中的參與而受到關注，miRNA在銀屑病中的作用逐漸被重視[6]。miRNAs可能在銀屑病的角質形成細胞的增生、分化和免疫激活異常中發揮重要作用。本文，我們構建了IL- 22誘導HaCaT細胞異常增生模型，并分析了miR- 29a- 3p在調節IL- 22誘導的HaCaT細胞異常增生中作用，初步評價結miR- 29a- 3p在銀屑病中的作用。本文是首次報道miR- 29a- 3p參與調節IL- 22誘導的角質形成細胞異常增生。

我們研究發現，IL- 22處理可以促進HaCaT細胞增殖，而過表達miR- 29a- 3p則可以抑制IL- 22對HaCaT細胞的影響。另外，我們發現過表達miR- 29a- 3p可以增加G1期HaCaT細胞的比例，同時減少S期細胞的比例，提示過表達miR- 29a- 3p可以引起HaCaT細胞G1期阻滯，進而抑制細胞增殖。另外，過表達miR- 29a- 3p可以促進IL- 22處理下HaCaT細胞的凋亡。我們的結果說明，miR- 29a- 3p可以抑制IL- 22誘發的角質形成細胞的異常增生。

miRNAs靶基因的鑒定對闡明miRNAs的功能十分重要。通過文獻查閱，我們發現miR- 29a- 3p的靶基因之一是信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)[7]。STAT3是一種重要的轉錄因子，其通過參與Th17細胞分化、角質形成細胞過度增生與異常分化、與炎癥細胞相互作用、真皮血管增生等重要病理過程在自身免疫性疾病如銀屑病發病中起關鍵作用[10- 11]。IL- 22作用于角質形成細胞后使細胞中STAT3表達升高[12]。miRNAs可以與靶向基因3′非編碼區的互補序列結合，從而抑制靶mRNA翻譯成蛋白質或者加速其降解[5]。因此，我們推測miR- 29a- 3p通過降低IL- 22誘導的STAT3高表達而發揮作用。研究發現，抑制STAT3可以誘發細胞周期的G1期阻滯，并促進細胞凋亡[13- 14]，這和miR- 29a- 3p過表達的作用一致。這也可以佐證我們的推測，即miR- 29a- 3p通過降低IL- 22誘導的STAT3高表達而發揮作用。

總之，我們發現IL- 22可以降低HaCaT細胞中miR- 29a- 3p的表達水平。IL- 22可以誘導HaCaT細胞過度增殖和細胞凋亡的抑制，而過表達miR- 29a- 3p則可以抑制IL- 22對HaCaT細胞的影響。基于miR- 29a- 3p對IL- 22誘導的HaCaT細胞的影響，我們推測miR- 29a- 3p可能在銀屑病發生發展中發揮重要作用，可能成為新的治療靶點。