基于網絡藥理學的復方丹參滴丸治療糖尿病視網膜病變的作用機制研究

王妙然，李秋艷，馬學竹，王旭杰,4，張雪雪,4，張蕊

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是繼發于糖耐量受損而造成視網膜損害，引起視力下降，甚至黃斑水腫、視網膜脫離及玻璃體出血，最終導致失明的一種疾病。作為一種嚴重的糖尿病微血管并發癥[1]，DR 也是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見的并發癥之一[2]。DR 發病機制較為復雜，是基因和環境共同作用的結果。現代醫學主要從血糖水平及糖尿病病程、高血壓及高血脂、多元醇代謝通路的異常、蛋白質非酶糖化產物的堆積、氧化應激反應增強、血管緊張素轉換酶系統、細胞因子等角度對其發生機制進行了初步的研究。

根據DR 的臨床證候，中醫將本病概括為“視瞻昏渺”“云霧移睛”“暴盲”“血灌瞳神”等范疇[3]。DR發病源于血瘀損傷眼部絡脈[3]，呂仁和等[4]認為糖尿病及其并發癥的發生存在血脈瘀滯的病機。文小敏等[5]認為瘀血為糖尿病視網膜病變發生發展的主要原因。張亞欣等[6]認為消渴病久肝腎陰虛，目失濡養，氣陰虧損、陰虛內熱，氣虛無力運血，陰虛血行滯澀，引起眼底脈絡瘀阻，導致DR 眼底改變；眼底脈絡瘀阻日久不消則生內熱，煉液成痰，或內生痰濕，痰瘀互結，導致新生血管、出血、機化、牽拉等視網膜增殖性病變。

復方丹參滴丸是在復方丹參片的基礎上，根據中醫傳統理論，采用現代高科技手段研制的一種純中藥滴丸劑，其含有的主要成分包括丹參、三七、冰片的提取物。現已證實復方丹參滴丸能夠改善DR的癥狀，療效確切[7]。但目前復方丹參滴丸對DR 的作用機制尚未完全闡明。

網絡藥理學（network pharmacology）是由Hopkins 于2007 年首先提出的[8]，建立在計算機虛擬計算、高通量組學數據分析等技術基礎上的一種方法，從系統的角度展現中藥成分靶點間的相互聯系和作用[9]，它能夠整體地分析中藥復方“多成分”的作用機制，也能獨立呈現某種特定疾病相關的 “活性成分-靶點-通路”，具有系統性、整體性的特點，與中醫中藥整體觀、辨證論治的原則相吻合，廣泛應用于中藥復方及單味藥的作用機制研究中[8,10-11]。本文擬采用網絡藥理學方法篩選復方丹參滴丸活性成分及靶點，分析其治療DR 的關鍵靶點和信號通路，以期為進一步的藥效物質基礎和作用機制實驗研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 復方丹參滴丸化合物及活性成分的篩選

本研究通過中藥系統藥理數據庫（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索復方丹參滴丸中丹參、三七、冰片所含有的化合物。依據藥代動力學中吸收、分布、代謝、排出特性，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）作為篩選指標，篩選閾值為OB≥30%，DL≥0.18，篩選出符合條件的活性成分。

1.2 復方丹參滴丸潛在靶點的反向預測及篩選

通過并在PubChem 數據庫中獲取相關成分SDF 格式化學結構，所有化學結構均采用ChemBio 3D Ultra 軟件轉換為Mol2 文件格式，將復方丹參滴丸化學成分Mol2 格式結構文件，上傳至PharmMapper 服務器(http://59.78.96.61/pharmmapper/)，以活性小分子為探針，搜尋潛在藥物靶點，進而得到虛擬篩選和預測化合物生物活性。參數設置如下，Generate Conformers：Yes；MaximumGenerated Conformations：300；Select Targets Set：Human Protein Targets Only(v2010，2241)；Number of Reserved Matched Targets(Max 1 000)：300，所有靶點預測結果按Fit score 由高到低進行排序。通過UniProt 數據庫中UniProtKB搜索功能(http://www.uniprot.org/)規范檢索到的藥物靶點的命名，輸入蛋白名稱并限定物種為“人”，將檢索得到的所有“Homo sapiens”靶標校正為其官方名稱(official symbol)。

1.3 糖尿病性視網膜病變已知治療靶點獲取

以“Diabetic retinopathy”為關鍵詞通過Genecard網站（www.genecards.org）檢索與糖尿病性視網膜病變對應的靶點，所得靶點即為糖尿病性視網膜病變已知靶點。

1.4 復方丹參滴丸活性成分靶點與DR 相關治療靶點相互作用網絡

利用String（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins,Version:11.0，http://string-db.org/) 平臺,選用Multiple proteins 工具,限定物種為“人”,以置信度大于0.4，將DR 的已知治療靶點映射到復方丹參滴丸的靶點上，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI），并保存其TSV 格式文件。并利用可視化軟件Cytoscape 3.7.2的“Network Analyzer”插件對網絡進行拓撲分析，網絡中節點（node）之間如存在調控作用關系則以邊（edge）相連。拓撲指標為自由度（degree）和介數（betweenness），二者用于說明網絡節點的重要性，其值越大，則該節點在網絡中越重要。

1.5 復方丹參滴丸治療DR 預測靶點富集分析

采用Metascape 基因聚類在線分析工具庫(http://metascape.org/gp/),基于上述所得到的所有互作靶標,進行GO 生物分析:選擇數據類型為“人”，然后進行Custom Analysis,分別選GO Biological Processes,GO Cellular Components 和GO Molecular Functions。再利用DAVID（http://david.nifcrf.gov/）對網絡合并后獲得的靶點蛋白進行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以人類全基因組為背景和參照，分析結果設置閾值EASE＜0.05，Count≥4，FDR＜0.01，P＜0.01 獲得顯著性較高的生物過程和通路富集分析結果，點擊通路名稱可以連接到KEGG 數據庫查看通路及詳情。

1.6 “活性成分-靶點-通路”網絡構建

為了更清晰的展現復方成分、核心靶點與通路之間的關系，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建并分析復方丹參滴丸“活性成分-靶點-通路”的網絡藥理圖。在網絡中，節點表示活性成分、靶點或通路。邊則代表了活性成分、靶點及通路之間的相互作用關系。

2 結果

2.1 復方丹參滴丸化合物、活性成分及潛在靶點的收集與篩選

TCMSP 平臺共收錄丹參化學成分202 個，符合篩選條件 (OB≥30%，DL≥0.18) 的共有40 個。TCMSP 平臺共收錄三七化學成分119 個，符合篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)的共有7 個。TCMSP 平臺共收錄冰片化學成分31 個，符合篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)的共有3 個。將符合篩選條件的化學成分結合文獻調研的結果，復方丹參滴丸共篩選出50 個有效成分。將復方丹參滴丸各活性成分在Pharmmapper 中返回的前300 個靶點在作用靶點依據匹配度由高到低排序。通過向Uniprot 數據庫的UniProtKB 搜索功能（http://www.uniprot.org/）中輸入蛋白靶點的名稱并限定物種為“人”，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱，即為丹參、三七、冰片活性成分的預測作用靶點。共對應得到丹參426 個，三七386 個，冰片307 個基因靶點。去除重復后共得到429 個靶點。結果復方丹參滴丸中不同活性化合物可作用于相同的靶點，同一個活性化合物也可作用于不同的靶點，這反映了其多成分、多靶點治療DR的作用模式。

2.2 已知DR 治療靶點及與復方丹參滴丸共同靶點的篩選

從GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫中檢索到2366 個DR 有關的已知治療靶點，按其相關性評分取≥5 分的靶點821 個。將獲得的靶點與復方丹參滴丸的潛在靶點交集，歸納得到98個可能相關聯的潛在作用靶點（圖1）。將丹參、三七、冰片與對應活性成分，活性成分與潛在作用靶點，潛在作用靶點與DR 對應關系以及屬性導入到Cytoscape，建立“藥物-成分-靶點-疾病”網絡（圖2）。

圖1 復方丹參滴丸作用于DR 靶點篩選

2.3 候選靶點蛋白互作網絡構建與拓撲分析

基于STRING 數據庫得到復方丹參滴丸活性成分預測出的98 個靶點的蛋白互作網絡，包括95個節點和1047 條邊（圖3）。經Cytoscape 3.7.2 軟件可視化并對網絡進行拓撲分析，拓撲指標選取自由度大于中位數的2 倍即38，介數大于中位數即0.00362648，拓撲指標分析后得出16 個靶點，作為復方丹參滴丸治療DR 的關鍵靶點，按核心程度由高至 低排名為 ALB、AKT1、MMP9、MAPK1、EGFR、MAPK8、CASP3、SRC、CAT、MMP2、NOS3、ESR1、HSP90AA1、HRAS、MAPK14 和PPARG。

圖2 復方丹參滴丸治療DR 的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.4 復方丹參滴丸治療DR 基因GO 富集分析

圖3 復方丹參滴丸治療DR 的PPI 網絡圖

將復方丹參滴丸活性成分預測出的98 個作用靶點通過Metascape 生物分子功能注釋系統對鑒別得到靶點進行GO 富集分析，共包括3 個分支，即生物過程 （biological process）、分子功能(molecular function)和細胞組分(cellular component)。其中生物過程細胞遷移的正調控、無機物反應、肽反應以及肌細胞增生靶點富集較集中（圖4）。在分子功能中磷酸轉移酶活性、醇基受體、輔因子結合、絲氨酸型肽酶活性、類固醇激素受體活性靶點富集較為集中（圖5）。細胞組分中與囊腔、膜筏、細胞外基質、受體復合物、粘著斑相關性最大。

2.5 復方丹參滴丸治療DR 基因KEGG 富集分析

圖4 復方丹參滴丸治療DR 潛在靶點的GO 生物學過程分析

圖5 復方丹參滴丸治療DR 潛在靶點的GO 分子功能分析

KEGG 通路分析共得出108 條通路，以P＜0.01作為指標，選取與DR 相關的通路，共37 條（表1）。信號通路主要涉及到細胞能量代謝、細胞增殖、分化、粘附、遷移，細胞外基質分泌、胰島素抵抗、腫瘤細胞新陳代謝、血管新生、免疫炎癥等方面，其中基因數目＞10 的有29 個條目，通路上靶點越多，指示復方丹參滴丸在治療DR 時越可能通過該通路發揮作用。

以PI3K-Akt 信號通路為例，富集的靶點為AKT1、AKT2、HRAS、JAK2、KIT、MET、RAF1、TEK、EGFR、FGF1、FGFR1、HSP90AA1、IGF1R、INSR、IL2、KDR、MAPK1、MAP2K1、NOS3、PIK3CG、PIK3R1、PGF、RAC1，由此可見復方丹參滴丸治療DR 是通過多通路、多靶點作用來實現的（圖6）。

2.6 “活性成分-靶點-通路”網絡分析

采用Cytoscape3.7.2 軟件構建37 條通路的“活性成分-靶點-通路”網絡模型（圖7），黃色菱形代表化合物，綠色三角形代表作用靶點，紅色橢圓形代表通路，以自由度調節網絡中的節點大小，從而直觀顯示網絡中節點的重要程度。由KEGG 分析得到37條通路中，共有59 個靶點，其中對應復方丹參滴丸的50 個活性成分。這37 條通路中有40 個活性成分來自于丹參，7 個活性成分來自于三七，3 個活性成分來自于冰片。其中來源于丹參的化合物較多。在丹參的活性成分中丹參環庚三烯酚酮（miltipolone）、紫丹參己素（przewaquinone F）、丹參醇A（danshenol A）和紫丹參戊素 （przewaquinone E）的作用靶點最多（自由度=48），接著是化合物紫丹參乙素（przewaquinone B，自由度=47），3α-羥基丹參酮IIA（3α-HyDRoxytanshinone IIA，自由度=47），丹參醇B（danshenol B，自由度=45）。這些活性成分具有較多的作用靶點，可能在復方丹參滴丸治療DR 的過程中起到較為核心的作用。在作用靶點方面，MAPK1，MAP2K1，PIK3R1，PIK3CG 和MAPK10 的自由度分別為82、79、78、76、70，有較多的活性成分配體。

表1 復方丹參滴丸治療DR 潛在靶點的KEGG 富集分析

圖6 復方丹參滴丸治療DR 靶點在PI3K-Akt 信號通路的富集情況。紅框內為復方丹參滴丸治療DR 靶點。AKT:AKT1,AKT2；(2)RTK:KIT,MET,TEK,EGFR,FGFR1,KDR,PGR；(3)GF:FGF1,IGF1R,INSR；(4)RI3K,PIK3CG,PIK3R1；(5)Aas:HRAS；(6)Cytokine:IL2；(7)MEK:MAP2K1；(8)ERK:MAPK1

在37 條通路中自由度較大的有癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、Rap1 信號通路、Ras 信號通路、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、粘著斑（focal adhesion）、FoxO 信號通路、催乳激素信號通路、VEGF 信號通路、HIF-1 信號通路，自由度分別為30、23、22、22、21、18、17、16、14、13。復方丹參滴丸高類藥性的活性成分作用靶點分布于不同的代謝通路，相互協調。

3 討論

DR 病理機制及發生發展是一個復雜的過程，各發病機制或途徑之間關系復雜，以多種方式相互作用并導致視網膜的氧化和炎癥損傷。就細胞而言，糖尿病患者的視網膜細胞大多都處于異常狀態并參與了糖尿病視網膜病變的發展。如抑制參與視覺循環、釋放神經遞質、調節血管功能[12-13]的Müller 細胞中VEGF 的表達可顯著改善糖尿病視網膜病變血管新生[14]以及血管通透性異常[15]。同樣，通過抑制視網膜色素上皮細胞特異蛋白65 的活性來減緩視覺周期活動[16-18]可顯著抑制糖尿病引起的毛細血管滲漏的進展和退變。即使是不屬于視網膜細胞的白細胞[19-20]和干細胞[21]也被認為參與了糖尿病視網膜病變血管病發癥的發展。就目前研究發現，沒有任何一條信號通路能完全解釋DR 的發病機制,也不能靠阻斷單一信號通路而達到治療DR 的效果[22]。

圖7 復方丹參滴丸治療DR 的“活性成分-靶點-通路”網絡圖

中醫藥對DR 的作用是從整體出發的多環節、多方位、多靶點的全面治療，并且各個環節彼此之間相互聯系、相互作用、相互影響。但由于中藥復方制劑成分復雜多樣，化學結構不確定，對其治療DR 的藥理機制尚不十分明確，缺乏深入的研究。本文通過檢索文獻與查詢科研成果后總結發現如下。

PI3K-Akt 信號通路是介導多種生長因子促存活的重要通路[23]。它的主要作用是對葡萄糖代謝、細胞生長、增殖和分化的過程進行調控，并可介導下游反應[24]。糖尿病時低氧和低血糖可激活PI3K 信號通路，活化的Akt 可引起血管擴張，血管重塑與血管新生[25]。過度的血管生成,導致視網膜病變和腎病。在糖尿病發生和發展過程中，持續的高血糖可能激活PI3K-Akt 細胞信號傳導通路，導致多種細胞因子（如NF-κB）的合成與釋放量上調，最終加速了DR的發生與發展。

Ras 信號通路被認為能有效調節細胞的增殖、分化、凋亡和癌性轉化等過程。Ras 在調控細胞增殖和生存的網絡信號途徑中處于中心的位置，而Rap1主要調控細胞的黏附、細胞間連接形成、細胞的分泌作用與極性[26]。Ras 與Rap1 在決定下游信號通路及受體的結構域上具有顯著的相似性[27]。同Rap1 一樣，都可通過不同的效應子按照不同的機制抑制或激活MAPK 通路[28]。MAPK 激活后定位在細胞核，通過磷酸化轉錄因子調控基因的表達，決定細胞是增殖還是分裂。

MAPK 信號通路在細胞增殖、凋亡、壞死、炎癥等病理過程中發揮重要調控作用[29]。在損傷環境下，大量的細胞因子和炎癥因子的釋放激活了細胞內的MAPK 通路，引起多種下游調控因子和效應分子被激活，從而誘發炎癥和凋亡[30-31]。炎癥和細胞凋亡是DR 的重要病理反應之一，并且往往導致視神經細胞的凋亡和壞死，從而影響視網膜損傷后的修復[32-33]。

FoxO 家族是Fox 基因家族中的一個亞族,為細胞核內一種轉錄因子，參與調節細胞增殖、分化和凋亡等過程[34]。它們介導胰島素或胰島素樣生長因子對細胞代謝、生長、分化、氧化應激、衰老、自噬和衰老等關鍵功能的抑制作用。在Fox 家族中的FoxO1廣泛表達于重要的胰島素感應器官，主要參與肝臟的糖異生調節，調控胰島素β 細胞的代謝、發育及增殖，調控脂肪和肌肉的分化及代謝[35-37]。

血管內皮生長因子（VEGF）是最有效的血管生成生長因子之一，并具有增加血管通透性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用[38]。血管在發育過程中，尖端細胞可感知VEGF 的梯度，導致絲狀偽足形成，并向VEGF 梯度遷移[39]。VEGF 對血管內皮細胞的增殖和遷移發揮重要作用[40]。目前抗VEGF 是眼部血管新生的標準治療策略,該治療策略已被廣泛應用于各種視網膜血管疾病,包括DR 和視網膜靜脈阻塞[41]。

HIF-1 信號通路在多種心血管疾病、炎癥、癌癥與急性臟器損傷等過程中發揮重要作用[42]。HIF-1 蛋白是缺氧狀態下調控血管新生的重要分子，缺氧能夠誘導HIF-1 蛋白的表達并通過HIF-1 蛋白與VEGF、EPO 基因啟動子區域的結合來啟動VEGF、EPO 的表達[43-44]。同時由于HIF-1α 能調控VEGF 的表達，進而調控血管增生[45]。

通過網絡藥理學的方法，發現復方丹參滴丸多個活性成分可以作用于同一靶點，單個成分也可以作用于多個靶點，通過多條通路協同發揮作用。這都體現出復方的多成分、多靶點、多通路整體調整的作用特點。對有效靶點進行KEGG 通路分析后發現復方丹參滴丸主要通過PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、Rap1 信號通路、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路、VEGF 信號通路以及HIF-1 信號通路對糖尿病視網膜病變進行治療調控。復方丹參滴丸能通過不同的調節方式對相應信號通路產生作用來達到對疾病的干預作用。其對各信號通路的調節是十分復雜的，可能通過細胞能量代謝、細胞增殖、分化、粘附、遷移，細胞外基質分泌、炎癥及免疫因子等多種信號通路作用于DR，本研究發現的主要通路有望成為新的治療DR 的靶點方向，但仍需進一步行相關研究驗證其具體作用機制。對于何種成分以何種方式作用于具體靶基因與各通路調節機制等具體細節更應當繼續加以深入研究。