丹參酮IIA對BN大鼠脈絡膜新生血管HIF-1α 和VEGF表達的影響

郝雪蓮，亢澤峰，陳水齡，劉健

年齡相關性黃斑變性 （age-related macular degeneration，AMD)，以中心性視力下降、中心暗影和視物變形為主要癥狀[1]。本病臨床上分為非新生血管型（即非滲出性或干性）以及新生血管型（即滲出性或濕性）。晚期多為嚴重型AMD，即黃斑中心區及中心凹地圖樣萎縮，或者有脈絡膜新生血管形成。其從脈絡膜向視網膜生長，可以突破Bruch’s膜，并在視網膜色素上皮和（或）視網膜下增殖[2]。由于新生血管的高滲透性易引起黃斑區反復出血、滲出，進而引起瘢痕機化導致患者喪失中心視力甚至致盲。缺氧是誘導血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）高表達的重要刺激因素，缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)相關信號傳導通路是脈絡膜新生血管 （choroidal neovascularization，CNV） 形成過程中的重要通路之一，是調控VEGF高表達的主要信號通路。本病可歸屬于中醫“視直如曲”“視瞻昏渺”“視瞻有色”等病的范疇[2]。中醫治療采用活血化瘀方法比較常見，其中常用有丹參、紅花、三七等[3]。丹參針劑有丹參酮IIA磺酸鈉注射液，其主要成分為丹參酮IIA。本研究通過半導體激光532 nm倍頻Ng:YAG激光誘導Brown Norway（BN）大鼠眼底CNV動物模型，觀察了中藥單體丹參酮IIA對BN大鼠視網膜脈絡膜新生血管HIF-1α 和VEGF表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物7～8周齡雄性BN大鼠60只，SPF級，體重在180～200 g（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）。動物許可證號：SCXK （京）2018-0006。

1.1.2主要儀器 半導體激光532 nm倍頻Ng:YAG激光(法國Quantel Medical公司），共焦激光眼底血管造影儀（德國海德堡），BIO-RAD全自動熒光定量PCR儀（CFX96）。

1.1.3主要試劑和藥物10%水合氯醛溶液（國藥集團），熒光素鈉注射液 （美國Alcon），TRIzol（CWBIO），PCR試劑盒（Vazyme），丹參酮IIA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業)，雷珠單抗眼用注射液(美國諾華制藥)。

1.2 方法

1.2.1分組 將60只BN大鼠隨機分為6組，每組分10只。A組，常規飼養；B組，0.9%生理鹽水8 ml腹腔內注射；C組，右眼眼內注射雷珠單抗眼用注射液（5μl）1次；D組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（10 mg/kg）；E組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（20 mg/kg）；F組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（40 mg/kg）[5]。

1.2.2造模方法 除A組外，其他組稱重全麻后剪掉胡須，復方托吡卡胺滴眼液1滴充分散大瞳孔，滴3次，鹽酸丙美卡因滴眼液、玻璃酸鈉滴眼液1滴后，固定好大鼠，鼠眼抵觸角膜并放置大小：1.8 cm×1.8 cm，厚度：0.15 mm蓋玻片觀察大鼠眼底，啟動532 nm半導體激光于眼后極部距離視盤2～3 PD處光凝8～10個點，光斑直徑50 μm，曝光時間0.05 s，功率300 mW[4]。

1.2.3給藥方法A組，不給藥；B組，腹腔注射8ml生理鹽水；C組，腹腔麻醉BN大鼠，在右眼角鞏膜后1～2 mm之間垂直進針，有落空感后立刻改變進針方向平行于眼軸進針2～3 mm，微量注樣器注入5 μl雷珠單抗；D-F組，用丹參酮IIA磺酸鈉注射液（10 mg/2 ml） 和滅菌注射用水分別配制低劑量(1.25 mg/ml)、中劑量(2.5 mg/ml)和高劑量(5 mg/ml)的丹參酮IIA磺酸鈉溶液。（大鼠腹腔注射給藥容積：5～10 ml/kg）按照大鼠體重取配置好的丹參酮溶液，給予D組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（10 mg/kg）；E組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（20 mg/kg）；F組，腹腔注射丹參酮IIA磺酸鈉注射液（40 mg/kg），總劑量控制在0.6～0.8 ml。

1.2.4取材麻醉BN大鼠，快速取眼球。取3 cm×3 cm無菌塑料薄膜鋪在無菌鹽水紗布上。在紗布上快速移除眼前節后夾到無菌塑料薄膜上，剪開成四瓣，隧道刀刮下Bruch’s膜-視網膜-脈絡膜復合體，棄鞏膜。卷起無菌塑料膜使復合體滑入1.5 ml無Nase酶EP管中，加Trizol液1 ml，置便捷式液氮罐中，收齊樣品后轉入-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 眼底造影檢查

各組隨機選取6只，分別于造模后第7 d、14 d和21 d時稱重、剪掉胡須，腹腔注射10%水合氯醛溶液（300 mg/kg）麻醉、配置10%熒光素鈉注射液（120 mg/kg）和1.25%吲哚菁綠注射液（36 mg/kg）混合后按體重尾靜脈注射上述混合液，行早期和晚期熒光素眼底血管造影（FFA）和吲哚青綠血管造影觀察（ICGA）。使用Image-Pro Plus 6.2軟件測量熒光照片平均光密度值。

1.4 RT-qPCR法檢測HIF-1α 和VEGF表達

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：按照Trizol說明書提取總RNA，所用引物序列（表1）。檢測提取濃度高進行cDNA合成。qPCR設置反應條件：95℃×3 min→95℃×15 s→58℃×30 s，39個循環，進行目的基因擴增，擴增完畢后開始分析結果，以GAPDH為內參照基因，比較對照組，得到目的基因表達的相對定量值，進行統計學分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS20.0系統軟件進行統計處理。計量資料用均值±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較用LSD-t檢驗。計數資料用百分率表示，組間采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FFA和ICGA表現

各組造模后7 d時FFA和ICGA表現（圖1）。造影早期可見點狀高熒光。造影中晚期見花環狀熒光滲漏。相應的ICGA晚期圖片可見熒光充盈，光斑周邊強熒光，中心呈現弱熒光。

圖1 各組FFA和ICGA圖。1A A組FFA圖；1B A組ICGA圖；1C B組晚期FFA圖，箭頭表示花環狀熒光滲漏；1D B組晚期ICGA圖，箭頭表示熒光充盈，周邊呈強熒光，中心呈弱熒光；1E C組FFA圖熒光滲漏不明顯；1F C組ICGA圖，周邊熒光強，中心弱；1G D組FFA圖，箭頭表示造影晚期花環狀熒光滲漏；1H D組ICGA圖，箭頭表示強熒光滲漏點；1I E組早期點狀FFA圖；1J E組早期點狀熒光滲漏ICGA圖；1K E組晚期網狀FFA熒光滲漏；1L E組晚期網狀ICGA熒光滲漏。FFA：眼底血管熒光造影；ICGA：吲哚菁綠脈絡膜造影

2.2 CNV形成率

大鼠激光光凝后不同時間點各組CNV形成率如下：7 d、14 d、21 d分別為68.7%、77.3%、75.2%，7 d時CNV形成率增高，14 d時CNV形成率達高峰值，21d趨向穩定。7 d時各組間CNV形成率比較（χ2=4.524，P=0.340）；14 d時各組間CNV形成率比較（χ2=2.814，P=0.589）；21 d時各組間CNV形成率比較（χ2=1.894，P=0.755）；7d、14d、21d比較（χ2=3.149，P=0.207）；7 d和14 d比較 （χ2=2.858，P=0.09）；7 d和21 d比較（χ2=1.564，P=0.211）；14 d和21 d比較（χ2=0.194，P=0.659），差異均無統計學意義（表2）。

表2 激光光凝后不同時間點各組CNV發生率的變化

2.3 FFA熒光滲漏AOD值

熒光滲漏平均光密度值比較：3個時間點各組間熒光滲漏平均光密度值比較，（F7d=33.697、F14d=47.894、F21d=59.382，均P=0.000）；7 d時，模型組與雷珠單抗組（t=15.100，P=0.000）、丹參酮低劑量組（t=2.956，P=0.025）、中劑量組（t=2.760，P=0.033），與高劑量組（t=1.579，P=0.165），均有統計學意義。雷珠單抗組與丹參酮低劑量組（t=5.170，P=0.002）、中劑量組（t=7.793，P=0.000）、高劑量組（t=11.390，P=0.000）比較，均有統計學意義；丹參酮3個劑量組兩兩比較，均無統計學意義（P＞0.05），14 d、21 d各組激光斑熒光滲漏趨勢同7 d組（表3）。

表3 各組FFA熒光滲漏AOD值比較（±s）

表3 各組FFA熒光滲漏AOD值比較（±s）

注：B組模型組；C組雷珠單抗組；D組丹參酮低劑量組；E組丹參酮中劑量組；F組丹參酮高劑量組。# 同一時間點多組比較，P＜0.05；*與模型組（B組）比較，P＜0.05；△與雷珠單抗組（C組）比較，P＜0.05

2.4 RT-qPCR檢測VEGF、HIF-1αmRNA相對表達量

對照組目的基因與內參GAPDH相對表達量進行校正，得到對照組目的基因mRNA相對表達量1時，得到模型組與各治療組目的基因mRNA相對表達量。

VEGF mRNA：3個時間點各組間VEGF mRNA因子相對表達量比較（F7d=40.775、F14d=17.223、F21d=20.591，均P=0.000）；其中21 d時，模型組與雷珠單抗組（t=10.940，P=0.000）、丹參酮低劑量組（t=6.525，t=0.003）比較，均有統計學意義；雷珠單抗組與丹參酮低劑量組（t=4.883，P=0.008）比較，有統計學意義；丹參酮低劑量組與中劑量組、高劑量組與中劑量組、高劑量組與低劑量組比較均無統計學差異（P＞0.05）（表4）。

HIF-1α mRNA：3個時間點各組間HIF-1α mRNA因子相對表達量比較（F7d=19.544，F14d=221.593、F21d=67.754，均P=0.000）；7 d、14 d、21 d時各組間HIF-1α mRNA相對表達量趨勢相似，與上述VEGF mRNA相對表達量21 d時趨勢一致（表4）。

表4 RT-qPCR檢測VEGF、HIF-1α mRNA相對表達量

3 討論

脈絡膜新生血管（CNV）是源自脈絡膜毛細血管的增殖性血管，也是眼底新生血管的主要表現形式之一。CNV是多種缺血缺氧性眼底疾病的共同終末病理環節，如年齡相關性黃斑變性、中心性滲出性脈絡膜視網膜病變（central exudative chorioretinopathy，CEC）、病理性近視（pathological myopia，PM）等，因其病理性血管管壁的高度通透性，極易導致局部出血和滲出產生，繼而引起組織機化和瘢痕形成，是目前嚴重影響老年和青年人群不可逆性視力嚴重損害及致盲的主要原因[6]。

目前，普遍認為局部組織缺氧和炎癥反應的發生是脈絡膜新生血管CNV形成的主要原因，其中缺氧環境是其形成的啟動因素，低氧環境誘發的缺氧誘導因子-1 (hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)促發的相關信號通路[7]的級聯反應，是最終導致CNV形成的核心通路之一。HIF-1由HIF-1α 和HIF-1β 兩個亞基組成，HIF-1α 是功能亞基，調節HIF-1的活性及功能，而HIF-1β 可能與HIF-1的穩定及其二聚體形成有關聯。常氧條件下，HIF-1α 發生羥基化，隨后被胞質中的蛋白水解酶水解成為小分子片段，失去其生物學功能；然而缺氧環境中可以誘導HIF-1α 的表達，過度表達的HIF-1α進入細胞核與HIF-1β 結合形成轉錄因子HIF-1，HIF-1與VEGF基因的5’ 端和3’ 端結合，誘導VEGF基因的表達，促進新生血管內皮細胞的大量增殖和遷移，促使新生血管形成[8]。近年研究顯示HIF-1α 介導的血管新生可能受其上游AKT途徑的調節[9]，AKT在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）條件下磷酸化，形成具有活性功能的AKT激酶，進一步激活雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，進而刺激HIF-1α 的表達，在調控VEGF表達、脈絡膜新生血管CNV形成的過程中發揮著重要的作用。

VEGF是已知促進CNV生成的最關鍵因子，VEGFs(VEGF家族及其受體)通過激活內皮細胞的有絲分裂與遷徙，誘導毛細血管形成來促進新生血管的生成[10]。在缺氧等條件誘導HIF-1α 表達增加時，其靶基因表達量也明顯增加[11-12]。

通過抑制VEGF在視網膜內皮細胞中的新生血管生成作用來減輕濕性AMD癥狀的有效方法是玻璃體腔內注射VEGF抗體。然而，由于注射的高成本和侵入性，這種治療并不總是負擔得起的。亢澤峰等應用加減駐景方治療缺血性眼病進行了大量體外研究[13-14]、體內研究[15-17]、臨床觀察[18-19]和理論闡述[20]，證明了加減駐景方對VEGF因子的抑制作用。加減駐景方臨床上用其治療缺血眼病取得了良好療效，能有效改善眼底病變，提高部分視功能。方中加減藥丹參有活血化瘀，增加血、氧供應之功效。丹參主要成分為丹參酮IIA，丹參酮IIA能明顯抑制腫瘤新生血管生成，減少VEGF產生[21-23]。其機制可能是通過降低HIF-1和NF-κB信號通路活化而引起級聯反應。基于此種假說課題組擬以動物模型為研究載體，從分子免疫、基因研究揭示中藥單體丹參酮IIA對CNV的作用機制，為臨床用藥提供實驗依據，為優化復方、新藥開發奠定基礎。

本實驗選用氪激光光凝眼底誘導BN大鼠脈絡膜新生血管動物模型作為研究對象，源于大鼠誘導的CNV發生率較高，大約為60%～70%，在光凝后短時間內（1周內）即可發生，而且光凝斑的熒光滲漏在10～14 d達到高峰，便于進行干預性研究；本次研究發現7 d、14 d、21 d各組大鼠激光光凝后CNV形成率分別為68.7%、77.3%、75.2%，表現出7 d CNV形成率明顯升高，14 d達到頂峰，21 d趨于平穩。此方法誘導CNV技術比較成熟穩定，且誘導CNV的條件可標準化，價格相對便宜，便于基因操作，可用于觀察單一基因過表達或高表達對CNV形成的影響[24]。

在各時間點，雷珠單抗能有效的抑制VEGF和HIF-1α 蛋白表達，且作用優于中藥單體（丹參酮IIA）組。但是中藥單體組不同劑量在一定的程度上可抑制VEGF和HIF-1α 蛋白的表達，從而抑制CNV動物模型的CNV形成。但是抑制VEGF和HIF-1α程度不隨中藥單體劑量增加而降低。

綜上所述，中藥單體丹參酮IIA磺酸鈉注射液可有效抑制CNV動物模型視網膜-脈絡膜中VEGF和HIF-1α 蛋白表達，從而減少CNV，具有廉價，副作用少，給藥方式安全，依從性高等優點。