厚樸酚與和厚樸酚衍生物的合成、表征及體外抗炎及抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

郭明鑫，廖世莉，吳 霞，王娟霞，陳德琪，史可欣，譚有珍，馮毅凡

廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣州 510006

為了繼承和發(fā)展中藥，研究者在中藥植物中分離和提取了許多具有良好藥理活性的天然單體，并基于有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)的理論基礎(chǔ)對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而保持或提高先導(dǎo)化合物的藥理活性。厚樸酚(magnolol)與和厚樸酚(honokiol)(圖1)是從厚樸中分離得到的含有烯丙基雙酚的天然活性單體[1]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[2,3]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，厚樸酚可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)[4,5]。和厚樸酚可以抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶、環(huán)氧合酶、谷氨酸過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生，減少炎癥介質(zhì)的釋放[6-8]。在抗細(xì)胞增殖方面，厚樸酚與和厚樸酚能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移，并能抑制腫瘤血管生成[9]。

圖1 厚樸酚(a)與和厚樸酚(b)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The chemical structures of magnolol(a) and honokiol(b)

然而，除了良好的藥理活性外，相對(duì)較差的溶解性影響了它的生物利用度和臨床療效[10]。毒性應(yīng)該引起更多的關(guān)注[11]，厚樸酚與和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)有很大的毒性[12]。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，厚樸酚與和厚樸酚對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性[13]。因此，作為一種具有一定潛力的先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性是研究重點(diǎn)之一。研究人員發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)上羥基被單甲基化或二甲基化的厚樸酚表現(xiàn)出良好的抗炎和抗皮膚癌活性，且厚樸酚甲基化產(chǎn)物的細(xì)胞毒性較厚樸酚明顯降低[14-16]。通過(guò)分子模擬平臺(tái)設(shè)計(jì)合成了一系列厚樸酚與和厚樸酚衍生物，酚羥基的甲基化衍生物對(duì)于Aβ蛋白和Tau蛋白的聚集均具有抑制作用[17]。另有研究表明，在厚樸酚苯環(huán)的羥基位置引入六元環(huán)，可以提高抗腫瘤活性，并且產(chǎn)物具有良好的水溶性(水溶性>1 000 mg/mL)[18]。Kim等[19]以和厚樸酚為原料，通過(guò)在酚羥基上引入酰基或葡萄糖，提高了其水溶性，并提高了其對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)厚樸酚與和厚樸酚烯丙基上的雙鍵被部分或完全改變時(shí)，其抗腫瘤活性會(huì)顯著降低甚至消失[16,19,20]。因此，厚樸酚與和厚樸酚的烯丙基是抗腫瘤活性必需基團(tuán)，而對(duì)其酚羥基的修飾則可改善其理化性質(zhì)和藥理活性。

作為合成1，3，4-噁二唑環(huán)化的先驅(qū)，Gibson[21]于1962年描述了1，3，4-噁二唑環(huán)化的反應(yīng)機(jī)理，此后越來(lái)越多的研究者致力于1，3，4-噁二唑類(lèi)化合物的合成，并不斷嘗試各種新方法合成具有特定生物效應(yīng)的1，3，4-噁二唑類(lèi)衍生物。Dewangan等[22]以苯甲酸和苯酰氯為原料合成了21個(gè)1，3，4-噁二唑類(lèi)化合物，考察其體內(nèi)抗炎和鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果顯示所有化合物的抗炎活性都比陽(yáng)性藥吲哚美辛要強(qiáng)。BiJu等[23]以酰肼和醛為原料合成了九個(gè)具有1，3，4-噁二唑環(huán)的化合物，采用角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹法檢測(cè)九個(gè)化合物的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，結(jié)果顯示化合物具有較好的抗炎和鎮(zhèn)痛活性，并且毒性較低。Ragab等[24]合成出13個(gè)含有二氫嘧啶的1，3，4-噁二唑類(lèi)化合物，并對(duì)60多種癌細(xì)胞系進(jìn)行了抗腫瘤篩查，篩選出白血病細(xì)胞株HL-60和MOLT-4效果最佳，可使MOLT-4細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G2/M期，進(jìn)而促細(xì)胞凋亡。胡昆等[25]設(shè)計(jì)合成鬼臼毒素4β-(1，3，4-噁二唑-2-氨基)衍生物，體外抗癌活性實(shí)驗(yàn)表明，目標(biāo)化合物對(duì)正常細(xì)胞的毒性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于陽(yáng)性對(duì)照，部分化合物顯示出較好的抗癌活性。

本課題組前期在厚樸酚的酚羥基上引入鏈狀烴基或三嗪環(huán)后活性結(jié)果顯示，其保留抗炎及抗腫瘤活性，并極大的降低了細(xì)胞毒性。因此，總結(jié)前人對(duì)構(gòu)效關(guān)系的研究以及實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，在厚樸酚與和厚樸酚羥基的位置上引入酯基結(jié)構(gòu)、酰肼結(jié)構(gòu)及含氮雜環(huán)1，3，4-噁二唑結(jié)構(gòu)，希望得到既能保持相當(dāng)?shù)纳锘钚裕帜芙档秃駱惴优c和厚樸酚毒性的衍生物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

JASCO FT-IR-4600微型光譜儀、JASCO VV550紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(JASCO Corporation，日本東京)；X-6型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京技術(shù)公司，中國(guó)北京)；AVANCEⅢ-500型超導(dǎo)核磁共振儀、VECTOR22FT-IR傅里葉紅外光譜儀(Bruker Corporation，德國(guó))；UPLC-Q-TOF-MS質(zhì)譜儀、2487/2996高效液相色譜儀(Waters Corporation，美國(guó))；Rigaku X射線衍射儀(Rigaku Corporation，日本東京)使用Cu-Kα輻射。本實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純；厚樸酚與和厚樸酚原料藥(純度大于98%)，購(gòu)買(mǎi)于Merck公司；無(wú)水試劑均按常規(guī)方法處理，使用屈臣氏純凈水；磺胺、鹽酸萘乙二胺，購(gòu)買(mǎi)于阿拉丁有限公司；胎牛血清(FBS)、高糖培養(yǎng)基(DMEM)及青霉素鏈霉素雙抗等生物試劑購(gòu)買(mǎi)于Gibco公司。小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)、人肝癌細(xì)胞株(HepG2)、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(H1299、A549)，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 厚樸酚與和厚樸酚衍生物的合成

1.2.1.1 合成策略

在圖1中所述反應(yīng)條件下，烯丙基雙酚的酚羥基通過(guò)取代反應(yīng)與溴乙酸甲酯反應(yīng)生成MM酯和HM酯。該反應(yīng)烷基化反應(yīng)完全，所得MM酯和HM酯收率高，可通過(guò)簡(jiǎn)單純化得到良好晶型。MM酯和HM酯與水合肼反應(yīng)生成具有酰肼結(jié)構(gòu)的MM和HM酰肼，隨后MM酰肼和HM酰肼通過(guò)與二硫化碳環(huán)合并與碘甲烷反應(yīng)生成具有1，3，4-惡二唑結(jié)構(gòu)的MM-522和HM-522。用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)結(jié)晶后衍生物進(jìn)行了純度測(cè)定，各衍生物的純度均在95%以上。

圖1 厚樸酚與和厚樸酚衍生物合成路線Fig.1 The synthetic routes of magnolol and honokiol derivatives.

1.2.1.2 MM酯與HM酯的合成

稱(chēng)取0.01 mol厚樸酚或和厚樸酚，0.08 mol無(wú)水Na2CO3，加入潔凈的三口燒瓶中，加入50 mL無(wú)水甲醇，攪拌升溫至60～65 ℃，滴加入0.04 mol溴乙酸甲酯，加熱回流8 h。反應(yīng)結(jié)束后，趁熱抽濾，濾液常溫放置，析出白色條狀結(jié)晶，得到化合物MM酯或HM酯。

1.2.1.3 MM酰肼與HM酰肼的合成

稱(chēng)取0.01 mol MM 酯或HM酯，加入潔凈的三口燒瓶中，加入50 mL無(wú)水乙醇，攪拌升溫至沸點(diǎn)，滴加0.04 mol水合肼，加熱回流1 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾液旋蒸至少量，加入少量純凈的去離子水，有白色沉淀析出，放置4 ℃冰箱過(guò)夜，抽濾，濾餅加適量乙腈重結(jié)晶，抽濾得MM 酰肼或HM酰肼。

1.2.1.4 1，3，4-惡二唑衍生物的合成

稱(chēng)取0.01 mol MM 酰肼或HM酰肼，0.02 mol氫氧化鉀，加入潔凈的三頸燒瓶中。加入100 mL無(wú)水乙醇，攪拌加熱至沸點(diǎn)，滴加入0.02 mol二硫化碳溶液，加熱回流12 h，溫度降至室溫，抽濾，濾液旋干，加入100 mL去離子水加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH=1～2，析出固體。取以上干燥的全部化合物，0.02 mol無(wú)水碳酸鉀，0.02 mol碘甲烷溶液加入三頸燒瓶，加入50mL無(wú)水乙醇，室溫?cái)嚢?2 h，抽濾，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，抽濾，濾液旋干，加入適量pH=12的堿水，超聲30 min，抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇反復(fù)重結(jié)晶得淡黃色膏狀固體為化合物MM-522或HM-522。

1.2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 MTT法測(cè)定衍生物的細(xì)胞毒性及抗腫瘤活性

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，通過(guò)傳代處理，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。細(xì)胞均勻貼壁后，吸去培養(yǎng)液，設(shè)調(diào)零組(僅含培養(yǎng)基)、空白組(含細(xì)胞、培養(yǎng)基)、給藥組(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、藥物)，給藥組加入濃度梯度的含藥完全培養(yǎng)基100 μL，分別為6.13、12.25、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μM，每個(gè)濃度平行6個(gè)復(fù)孔，調(diào)零組和空白組加入同等體積的完全培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，每孔加入100 μL含MTT的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4 h。小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震搖10 min混勻，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。同樣，通過(guò)MTT法[26]評(píng)價(jià)衍生物對(duì)MCF-7、HepG2、A549及H1299的增殖抑制作用。

1.2.2.2 炎性因子NO、IL-1β及TNF-α的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，通過(guò)傳代處理，調(diào)整細(xì)胞密度5×105個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)24 h，小心吸棄上清，分組給藥，給藥1 h后，炎癥模型組與給藥組加入適量LPS，使其終濃度為5 μg/mL，空白組給予等量的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩７謩e取各給藥組細(xì)胞上清液以及各濃度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL于96孔板中，向其中加入50 μL A液(磺胺10 mg/mL+0.06%濃磷酸)，再加入50 μL B液(N-1-萘乙二胺鹽酸鹽，1 mg/mL)，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定546 nm處吸光度值，用ELISACalc軟件進(jìn)行計(jì)算。同法使用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型，收集上清液，按照各炎癥因子ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(17.0版本)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示(Mean ± SD)。兩組數(shù)據(jù)之間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)法，不滿足方差齊性者采用兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)同統(tǒng)計(jì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 衍生物結(jié)構(gòu)表征

MM酯：二甲基-2，2′-((5，5′-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，2′-取代)二乙酸酯，白色晶狀固體，產(chǎn)率85.3%；mp.89～93 ℃；紫外光譜顯示其在208和282 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 071、2 965、2 908、1 762、1 631、1 596、1 211、1 079 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.182 5 [M+H]+(calcd for C24H27O6，411.180 8)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.01～5.11(4H，m)，5.92～6.00(2H，m，H-2)，3.32(4H，d，J= 7.0 Hz，H-3)，7.10，7.09(2H，dd，J= 2.5，2.0 Hz，H-5)，6.88(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，H-6′)，7.04(2H，d，J= 2.5 Hz，H-9，H-9′)，4.67(4H，s，H-10，H-10′)，3.65(6H，s，H-12，H-12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.5(C-1，C-1′)，137.8(C-2，C-2′)，39.2(C-3，C-3′)，132.1(C-4，C-4′)，128.2(C-5，C-5′)，112.6(C-6，C-6′)，153.6(C-7，C-7′)，127.3(C-8，C-8′)，131.3(C-9，C-9′)，65.4(C-10，C-10′)，169.4(C-11，C-11′)，51.6(C-12，C-12′)。MM酯為三斜晶系P-1空間群，a軸7.8593?，b軸10.9479?，c軸13.3607?，α=107.548°，β=101.872°，γ=101.872°，體積1 066.65[13]。

HM酯：二甲基-2，2′-((3，5′-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，4′-取代)二乙酸酯，白色晶狀固體，產(chǎn)率82.6%；mp.76～79 ℃；紫外光譜顯示其在211、255、287 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：2 908、2 856、1 766、1 492、1 443 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.184 6 [M+H]+(calcd for C24H27O6，411.180 8)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.06～5.12(2H，m，H-1)，5.00～5.04(2H，m，H-1′)，5.99～6.06(1H，m，H-2)，5.91～5.98(1H，m，H-2′)，3.40(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3)，3.32(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3′)，6.92(1H，s，H-5)，7.07，7.08(1H，dd，J= 2.0 Hz，H-6)，7.35(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.00(1H，s，H-7′)，7.05(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9)；7.33(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9′)，4.76(2H，s，H-10)，4.85(2H，s，H-10′)，3.68(3H，s，H-12)，3.71(3H，s，H-12′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.5(C-1)，115.6(C-1′)，137.9(C-2)，136.8(C-2′)，38.6(C-3)，34.0(C-3′)，132.7(C-4)，129.5(C-4′)，112.5(C-5)，154.3(C-5′)，127.9(C-6)，128.1(C-6′)，152.7(C-7)，111.3(C-7′)，130.8(C-8)，127.6(C-8′)，130.7(C-9)，130.4(C-9′)，64.9(C-10)，64.8(C-10′)，169.3(C-11)，169.3(C-11′)，51.8(C-12)，51.7(C-12′)。如圖2單晶衍射顯示：HM酯為三斜晶系P-1空間群，a軸9.1932?，b軸9.5749?，c軸13.2782?，α=99.755°，β=90.539°，γ=112.464°，體積1 061.0。

MM酰肼：2，2′-((5，5′-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，2′-取代基)二(氧))二(乙酰肼)，白色粉末狀固體，產(chǎn)率48.9%；mp.135～138 ℃；紫外光譜顯示其在214和285 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 316、3 184、3 042、2 913、1 667、1 428、1 408 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.200 9 [M+H]+(calcd for C22H27N4O4，411.203 2)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.02～5.11(4H，m，H-1，H-1′)，5.92～5.99(2H，m，H-2，H-2′)，3.33(4H，d，J= 7.0 Hz，H-3，H-3′)，7.12，7.10(2H，dd，J= 2.5，2.0 Hz，H-5，H-5′)，6.91(2H，d，J= 8.5 Hz，H-6，H-6′)，7.03(2H，d，J= 2.5 Hz，H-9，H-9′)，4.43(4H，s，H-10，H-10′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-1，C-1′)，137.9(C-2，C-2′)，38.6(C-3，C-3′)，132.3(C-4，C-4′)，128.4(C-5，C-5′)，112.5(C-6，C-6′)，153.6(C-7，C-7′)，127.4(C-8，C-8′)，131.2(C-9，C-9′)，66.9(C-10，C-10′)，166.9(C-11，C-11′)。

圖2 化合物HM酯的晶型(CCDC編號(hào)：19589)Fig.2 The crystal pattern of compound HM ester(CCDC Number：19589)

HM酰肼：2，2′-((3，5′-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，4′-取代基)二(氧))二(乙酰肼)，白色粉末狀固體，產(chǎn)率56.3%；mp.129～134 ℃；紫外光譜顯示其在210、254、286 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 419、1 675、1 501 cm-1；HR-ESI-MS：m/z411.204 9 [M+H]+(calcd for C24H27N4O4，411.203 2)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.01～5.04(2H，m，H-1)，5.06～5.12(2H，m，H-1′)，5.91～5.99(1H，m，H-2)，6.00～6.07(1H，m，H-2′)，3.33(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3)，3.44(2H，d，J= 7.0 Hz，H-3′)，6.93，6.92(1H，dd，J= 2.0 Hz，J= 3.0 Hz，H-5)，7.08(1H，d，J= 2.5 Hz，H-6)，7.40，7.38(1H，dd，J= 2.5Hz，J= 2.0 Hz，H-6′)，6.91(1H，s，H-7′)，7.06(1H，s)；7.33(1H，d，J= 2.0 Hz，H-9′)，4.43(2H，s，H-10)，4.54(2H，s，H-10′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.6(C-1)，115.5(C-1′)，137.9(C-2)，136.1(C-2′)，38.6(C-3)，33.9(C-3′)，132.7(C-4)，129.8(C-4′)，113.2(C-5),154.6(C-5′)，128.0(C-6)，128.2(C-6′)，153.1(C-7)，111.4(C-7′)，130.8(C-8)，127.9(C-8′)，130.6(C-9)，130.4(C-9′)，66.9(C-10)，66.7(C-10′)，166.9(C-11)，166.8(C-11′)。

MM-522：5，5′-(((3′，5-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，4′-取代基)二氧)二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，淡黃色油狀液體，產(chǎn)率36.9%；紫外光譜顯示在217和283 nm處有最大吸收；IR(KBr)ν：3 073、2 933、1 589、1 641、1 486、1 431 cm-1；HR-ESI-MS：m/z523.143 4 [M+H]+(calcd for C26H27N4O4S2，523.147 4)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.00～5.07(4H，m，H-1，H-1′)，5.89～5.98(2H，m，H-2，H-2′)，3.32(4H，d，J= 7.0 Hz，H-3，H-3′)，7.15(2H，d，J= 1.0 Hz，H-5，H-5′)，6.98(2H，d，J= 2.0 Hz，H-6，H-6′)，7.14(2H，s，H-9，H-9′)，5.25(4H，s，H-10，H-10′)，2.66(6H，s，H-13，H-13′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.7(C-1，C-1′)，137.7(C-2，C-2′)，38.6(C-3，C-3′)，132.9(C-4，C-4′)，128.5(C-5，C-5′)，113.6(C-6，C-6′)，153.0(C-7，C-7′)，127.4(C-8，C-8′)，131.3(C-9，C-9′)，60.2(C-10，C-10′)，163.6(C-11，C-11′)，165.5(C-12，C-12′)，14.1(C-13，C-13′)。

HM-522：5，5′-(((3′，5-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，4′-取代基)二氧)二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，淡黃色液體，產(chǎn)率24.5%；紫外光譜顯示在206、250、288 nm有最大吸收；IR(KBr)ν：3 073、3 013、2 973、2 930、1 638、1 692、1 483、1 428 cm-1；HR-ESI-MS：m/z523.140 8 [M+H]+(calcd for C26H27N4O4S2，523.147 4)；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：4.96～5.02(2H，m，H-1)，5.04～5.11(2H，m，H-1′)，5.87～5.94(1H，M，H-2)，5.94～6.01(1H，m，H-2′)，3.32(2H，s，H-3)，3.35(2H，s，H-3′)，7.14，7.12(1H，dd，J= 2.5，J= 2.0 Hz，H-5)，7.16～7.18(1H，m，H-6)，7.30，7.29(1H，dd，J= 2.5，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.11(1H，d，J= 2.0 Hz，H-7′)，7.16～7.18(1H，m，H-9)，7.27(1H，d，J= 2.5 Hz，H-9′)，5.31(2H，s，H-10)，5.43(2H，s，H-10′)，2.68(3H，s，H-13)，2.72(3H，s，H-13′)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：115.3(C-1)，115.7(C-1′)，137.8(C-2)，136.5(C-2′)，38.6(C-3)，33.7(C-3′)，133.6(C-4)，130.0(C-4′)，114.1(C-5)，154.1 C-5′)，128.0(C-6)，128.2(C-6′)，152.6(C-7)，112.6(C-7′)，131.0(C-8)，127.9(C-8′)，130.8(C-9)，130.5(C-9′)，60.2(C-10)，69.9(C-10′)，163.6(C-11)，163.5(C-11′)，165.6(C-12)，165.6(C-12′)，14.2(C-13)，2.7(C-13′)。

用結(jié)構(gòu)分析的方法對(duì)6種衍生物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。鑒于各衍生物的結(jié)構(gòu)相似性，以化合物MM-522和HM-522的結(jié)構(gòu)表征為例，證明反應(yīng)的可靠性和真實(shí)性。HRMS(ESI)證實(shí)化合物MM-522的分子式為C26H26N4O4S2。紅外光譜表明其含有芳香氫(3 073.98 cm-1)、甲基氫(2 933.2 cm-1)、碳鏈雙鍵(1 589.06 cm-1)、羰基(1 641.13 cm-1)和苯環(huán)(1 486.85、1 431.89 cm-1)。化合物MM-522的1H NMR譜顯示其結(jié)構(gòu)中有1個(gè)甲基單峰位于最高場(chǎng)[2.66(6H，s)]為13和13′位上的氫信號(hào)，1個(gè)亞甲基雙重峰[3.32(4H，d，J= 7.0 Hz)]為3和3′位上的氫信號(hào)，由于受到2及2′位上氫的影響使其分裂為雙重峰，1個(gè)亞甲基單峰位于低場(chǎng)[5.25(4H，s)]為10和10′位上的氫信號(hào)，由于受到氧原子的影響，其化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，1個(gè)烯鍵多重峰[5.01～5.09(4H，m)]為1和1′位上的氫信號(hào)以及1個(gè)次甲基多重峰[5.89～5.98(2H，m)] 為2和2′位上的氫信號(hào)，2個(gè)次甲基雙重峰[7.15(2H，d，J= 1.0 Hz)，6.98(2H，d，J= 2.0 Hz)]，1個(gè)次甲基單峰[7.15(2H，s)]為苯環(huán)上氫的信號(hào)。根據(jù)13C NMR譜和DEPT譜顯示有26個(gè)碳信號(hào)，其中包括6個(gè)亞甲基信號(hào)分別為3，3′，10，10′，1，1′位上的碳信號(hào)，10個(gè)甲基信號(hào)或次甲基信號(hào)，其中化學(xué)位移值位于最高場(chǎng)的為13和13′位上的碳信號(hào)，10個(gè)季碳信號(hào)。

如圖3-a中所示，根據(jù)1H-1H COSY、HMBC表明H-3，3′與H-2，2′及H-1，1′互為偶合關(guān)系，驗(yàn)證了1H NMR里的推論；而H-5，5′與H-6，6′互為偶合關(guān)系，因此表明化學(xué)位移為7.15的2H單峰為9和9′的信號(hào)；根據(jù)HMBC顯示H-10，10′與C-7，7′以及C-11，11′有遠(yuǎn)程偶合關(guān)系，可以得出1，3，4-惡二唑環(huán)通過(guò)10位亞甲基與厚樸酚7位上的酚羥基相連；又根據(jù)HMBC顯示C-12，12′與H-13，13′有遠(yuǎn)程偶合得出1，3，4-惡二唑環(huán)的12位被甲硫基取代。綜上所述，此化合物的結(jié)構(gòu)被確定為5，5′-(((5，5′-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，2′-取代基)二氧))二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，簡(jiǎn)稱(chēng)為MM-522。

圖3 MM-522(a)和HM-522(b)的HMBC和1H-1H COSY相關(guān)示意圖Fig.3 The HMBC and 1H-1H COSY correlation of MM-522(a) and HM-522(b)

HM-522的分子式為C26H26N4O4S2。紅外光譜表明HM-522的結(jié)構(gòu)中含有芳香氫(3 073.98和3 013.23 cm-1)、甲基氫(2 973.70和2 930.31 cm-1)、碳?xì)滏滊p鍵(1 638.23 cm-1)。羰基(1 692.23 cm-1)和苯環(huán)(1 483.96和1 428.99 cm-1)。化合物HM-522的1H NMR譜表明其結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)甲基單峰[2.68(3H，s)，2.72(3H，s)]分別為13和13′位上H的信號(hào)， 兩個(gè)次甲基多重峰[5.87～5.94(1H，m)，5.94～6.00(1H，m)]為2和2′位上H的信號(hào)，兩個(gè)烯鍵多重峰[4.96～5.02(2H，m)，5.04～5.11(2H，m)]分別為1和1′位上H的信號(hào)，四個(gè)亞甲基單峰[5.31(2H，s)，5.43(2H，s)，3.32(2H，s)，3.35(2H，s)]，苯環(huán)上六個(gè)H信號(hào)[7.14，7.12(1H，dd，J= 2.5 Hz，J= 2.0 Hz)，7.16～7.18(2H，m)，7.30，7.29(1H，dd，J= 2.5 Hz，J= 2.0 Hz)，7.11(1H，d，J= 2.0 Hz)，7.27(1H，d，J= 2.5 Hz)]。13C NMR譜和DEPT譜表明有26個(gè)碳信號(hào)，其中包括10個(gè)甲基或者次甲基信號(hào)，6個(gè)亞甲基和10個(gè)季碳。如圖3-b所示，H-2，2′與 H-1，1′和H-3，3′具有關(guān)系，直接相連。H-10與C-7、C-11有遠(yuǎn)程偶合關(guān)系而H-10′與C-5′、C-11′，可以得出兩個(gè)1，3，4-惡二唑環(huán)分別通過(guò)10和10′位亞甲基鍵與厚樸酚7和5′位上的酚羥基相連；又根據(jù)HMBC顯示C-12與H-13，C-12′與H-13′有遠(yuǎn)程偶合得出1，3，4-惡二唑環(huán)的12和12′位被甲硫基取代。綜上所述，此化合物的結(jié)構(gòu)被確定為5，5′-(((3′，5-聯(lián)丙烯-[1，1′-聯(lián)苯]-2，4′-取代基)二氧)二(亞甲基))二(2-(甲硫基)-1，3，4-噁二唑)，簡(jiǎn)稱(chēng)為HM-522。

由于第三步反應(yīng)為環(huán)化反應(yīng)，產(chǎn)率較低，影響因素較多，因此通過(guò)考察溶劑、溫度、時(shí)間、催化劑、原料配比等因素對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。以無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、異丙醇、二氯甲烷(DCM)、乙腈、1，4-二氧六環(huán)為反應(yīng)溶劑，由于二氯甲烷的沸點(diǎn)太低，達(dá)不到反應(yīng)要求的溫度。當(dāng)丙酮和1，4-二氧六環(huán)作為溶劑時(shí)，此反應(yīng)不發(fā)生，而當(dāng)乙腈和無(wú)水乙醇作為溶劑時(shí)產(chǎn)率較高，但兩者產(chǎn)率相差不大，鑒于乙腈毒性較大，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇無(wú)水乙醇作為反應(yīng)溶劑。在溫度方面，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)達(dá)到沸點(diǎn)時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大。而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，收率并沒(méi)有隨之增加。考察了氫氧化鉀、氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉、三乙胺和甲醇鈉對(duì)反應(yīng)收率的影響。結(jié)果表明，以無(wú)水碳酸鈉為催化劑時(shí)，無(wú)水碳酸鈉的收率最高。另外，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間12 h，原料配比為酰肼∶無(wú)水碳酸鈉∶二硫化碳=1∶2∶2時(shí)，中間體的收率最高，為66.01%。此外，值得注意的是，本研究采用溶劑法對(duì)各衍生物進(jìn)行純化，避免應(yīng)用半制備液相色譜儀及硅膠層析柱等處理方式，所獲得的衍生物純度高且適用于體外活性研究。

2.2 生物學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 衍生物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法研究厚樸酚與和厚樸酚各衍生物對(duì)細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-a所示，厚樸酚與和厚樸酚對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的毒性較大，厚樸酚濃度在200～400 μM時(shí)就能將細(xì)胞全部殺死，而和厚樸酚毒性較厚樸酚大，濃度在50～100 μM時(shí)就能將細(xì)胞全部殺死；在衍生物中，MM酯與MM-522在800 μM時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性仍然較小，細(xì)胞存活率較高，而其他的衍生物隨著藥物濃度的升高，對(duì)細(xì)胞存活率的影響也增大，細(xì)胞存活率降低，但是所有衍生物的毒性與厚樸酚相比都有所降低。各處理組對(duì)正常細(xì)胞的IC50值如表1所示。

2.2.2 衍生物的體外抗炎作用研究

如圖4-b所示，正常RAW 264.7細(xì)胞在未受LPS刺激的情況下幾乎不分泌炎性介質(zhì)NO；然而，細(xì)胞在受到LPS刺激后，炎癥模型組較對(duì)照組分泌大量的NO，有顯著性的變化(P<0.01)，而陽(yáng)性藥布洛芬組NO濃度較炎癥模型組顯著性降低(P<0.01)，說(shuō)明此炎癥模型造模成功。通過(guò)衍生物干預(yù)之后，各實(shí)驗(yàn)組中NO的分泌均受到不同程度的抑制作用，其中MM酯組(11.62 μmol/L)、MM-522組(10.52 μmol/L)、HM酰肼組(10.07 μmol/L)、HM-522 組(12.74 μmol/L)對(duì)NO的抑制作用與陽(yáng)性藥布洛芬相當(dāng)，且HM 酰肼對(duì)NO的抑制作用最強(qiáng)。所有衍生物的抑制作用均強(qiáng)于厚樸酚組(14.47 μmol/L)，并與和厚樸酚組(11.21 μmol/L)抑制作用相當(dāng)。

化合物Compound半數(shù)抑制濃度IC50(μmol/L)厚樸酚 Magnolol52.23 ± 2.51MM酯 MM ester>800**MM酰肼 MM hydrazide104.23 ± 3.42*MM-522 > 800*和厚樸酚 Honokiol22.18 ± 1.46HM酯 HM ester220.08 ± 3.53*HM酰肼 HM hydrazide238.01 ± 4.53*HM-522 304.24 ± 5.21*

注：與原料藥對(duì)照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with control group,*P<0.05;**P<0.01.

根據(jù)4-c所示，RAW 264.7細(xì)胞受到LPS刺激后，炎癥模型組較對(duì)照組分泌大量的IL-1β，有極顯著的差異(P<0.01)。各實(shí)驗(yàn)組中IL-1β的分泌均受到不同程度的抑制作用，其中MM-522(12.87 pg/mL)的抑制作用最強(qiáng)，其他衍生物的抑制作用與布洛芬(16.68 pg/mL)相當(dāng)或較強(qiáng)。所有衍生物的抑制作用與厚樸酚組(12.23 pg/mL)、和厚樸酚組(14.73 pg/mL)抑制作用相當(dāng)。從圖4-d可知，所有藥物組TNF-α濃度與炎癥模型組相比，都有顯著性變化(P< 0.01)，因此均能不同程度地抑制LPS刺激后的RAW 264.7巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，抑制強(qiáng)度與厚樸酚(16 618.66 pg/mL)、和厚樸酚(16 326.89 pg/mL)以及陽(yáng)性藥布洛芬(15 028.40 pg/mL)相當(dāng)，其中MM酰肼(12 554.76 pg/mL)與HM酰肼(12 407.54 pg/mL)抑制TNF-α分泌的作用最強(qiáng)。因此衍生物在體外抗炎活性方面到達(dá)了增效減毒的作用。

2.2.3 衍生物體外抗腫瘤作用研究

為了初步探究各衍生物的體外抗腫瘤活性，本實(shí)驗(yàn)以MCF-7、HepG2、H1299及A549為研究對(duì)象，采用MTT法以厚樸酚與和厚樸酚為對(duì)照對(duì)衍生物的體外抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2、表3中所示，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)修飾后，原料藥厚樸酚與和厚樸酚對(duì)四種腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用，而衍生物的抑制作用有所減弱，但也表現(xiàn)出明顯的抑制作用。衍生物HM酯對(duì)MCF-7表現(xiàn)出較好的抑制作用，濃度在100 μmol/L的時(shí)候，細(xì)胞存活率大約是30%，并且具有濃度依賴(lài)性；對(duì)于HepG2抑制實(shí)驗(yàn)中，和厚樸酚在低濃度時(shí)就能將癌細(xì)胞全部殺死，衍生物HM酯和MM酯均表現(xiàn)出了較好的抑制作用，MM酯在低濃度時(shí)細(xì)胞存活率低于30%；衍生物HM酯、HM酰肼對(duì)A549表現(xiàn)出較好的抑制作用，HM酯在濃度為400 μmol/L的時(shí)候，幾乎殺死全部A549；在H1299抑制實(shí)驗(yàn)中，衍生物MM酰肼、HM酯、HM酰肼均表現(xiàn)出較好的抑制作用。

圖4 各衍生物的細(xì)胞毒性及其對(duì)炎癥因子影響Fig.4 Cytotoxicity of derivatives and their effects on inhibiting inflammatory factors

3 結(jié)論

基于“減毒增效”及總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)修飾并合成了6個(gè)衍生物，其中，MM酰肼、MM-522、HM酯、HM酰肼及HM-522國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。所有衍生物的細(xì)胞毒性與原料相比都有所降低。在抗炎活性探究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)衍生物在保持較低細(xì)胞毒性的同時(shí)，衍生物MM酯、HM酰肼及MM-522具有良好抑制炎性介質(zhì)生成的作用。在評(píng)價(jià)衍生物腫瘤的活性評(píng)價(jià)中，原料藥厚樸酚與和厚樸酚具有良好的抗腫瘤活性，而衍生物的抗腫瘤活性略有下降。但是，MM酯、HM酯在保持低細(xì)胞毒性的情況下，仍然表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。由此可知，原料藥厚樸酚于和厚樸酚良好的的抗腫瘤作用與其較強(qiáng)的細(xì)胞毒性存在某種關(guān)聯(lián)。本研究中的MM酰肼、MM-522、HM酯及HM酰肼等對(duì)細(xì)胞毒性較小，且抗炎及抗腫瘤活性優(yōu)于陽(yáng)性藥物及原料藥。因此，本研究達(dá)到降低毒性，維持藥效的目的，對(duì)先導(dǎo)化合物的開(kāi)發(fā)和修飾具有一定的研究意義。

表2 衍生物對(duì)MCF-7和HepG2的存活率Table 2 The survival ratio of derivatives against MCF-7 and HepG2

注：濃度單位：μmol/L，下同。

Note:Concentration unit:μmol/L,the same below.

表3 衍生物對(duì)A549和H1299的存活率Table 3 The survival ratio of derivatives against A549 and H1299