數據挖掘中藥治療癲癇藥對“陳皮-半夏”及其網絡藥理學作用機制分析

王晶慧，趙慧亮，靳 翔，侯 璐

1西南大學藥學院中醫藥學院，重慶 400715；2山西大學中醫藥現代研究中心，太原 030006；3山西農業大學生命科學學院，太谷 030800

癲癇是大腦神經元突然異常放電而致一時性大腦功能失調的慢性綜合性神經系統疾病[1]。中醫認為癲癇病機為邪閉腦竅、元神失控，治療癲癇的重點在于調理機體整體功能[2]。中醫抗癲癇已有確切的臨床實用價值，許多中藥和復方的療效已被大量的臨床和實驗研究所證實。但中藥方劑種類多、配伍復雜，本研究利用數據挖掘與網絡藥理學探究臨床遣方治療癲癇的用藥規律及其作用機制[3]。利用Apriori關聯規則算法從現代文獻中整理出繁雜、多源化的治療癲癇藥方，得到常用藥對“陳皮-半夏”。

半夏、陳皮為祛痰常用藥，歷代醫家認為，癲癇發病以痰為基礎，多風、火而觸動，阻于心竅而發病，治療以祛痰為要義。但由于中藥多成分、多靶點的特點，“陳皮-半夏”所含化學成分的作用機制尚不明確。網絡藥理學是在系統生物學與計算機技術高速發展的基礎上發展起來的，基于“藥物-靶點-疾病”相互作用的網絡基礎上，用網絡分析的方法研究藥物作用機理[4]。網絡藥理學注重藥物作用的整體效果，采用網絡分析的方法觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，為中醫藥的現代化研究提供了新的指導思想。因此，借助網絡藥理學方法篩選陳皮、半夏的主要活性成分及其作用靶點，尋找其影響的通路與疾病之間的相關性，對于從宏觀角度闡釋陳皮-半夏配伍治療癲癇的作用機制具有重要意義。

本文通過關聯規則挖掘得出文獻中治療癲癇使用頻率最高的藥對“陳皮-半夏”。對陳皮-半夏藥對開展網絡藥理學研究，進一步明確陳皮、半夏活性成分及作用靶點，并分析其治療癲癇的作用機制，對癲癇的治療與相關藥物的使用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 中藥復方的收集

以中國期刊全文數據庫、維普數據庫、萬方數據庫為數據來源，運用計算機檢索功能輸入“癲癇”、“中藥 癲癇”、“中醫 癲癇”下載相關文獻。去重后根據納入標準和排除標準篩選出符合標準的文獻[5]。

排除標準：(1)排除并發癥、后遺癥類、探討類、文獻內無具體用方類文獻；(2)排除中藥治療癲癇的動物類文獻；(3)排除治療小兒癲癇的相關文獻；(4)排除非內服，外用治療類文獻；(5)排除利用針灸、推拿治療癲癇類文獻；(6)排除非辨證論治類文獻。

納入標準：(1)所選文獻應完整性高、藥方完整無缺失；(2)所選文獻已進行臨床治療并有一定數量的治愈病例；(3)所選文獻為公開發表并明確用于治療癲癇；(4)所選文獻治療方法為口服。

1.2 運用Apriori關聯規則算法挖掘藥對

將中藥名稱標準化后錄入Excel表格，例如將“棗仁”“酸棗核”統一命名為“酸棗仁”，將“全蟲”“蝎子”統一命名為“全蝎”，建立目標數據庫。運用SPSS Modeler軟件處理目標數據庫內的中藥，運用Apriori關聯規則算法建立數據挖掘模型，得出使用頻率最高的藥對[6]。

1.3 藥對中所含化學成分的收集與篩選

在傳統中藥數據庫 TCMSP[7](http://tcmspw.com/tcmsp.php)中收集藥對的主要化學成分。結合口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)篩選所收集到的化學成分，建立藥對的化學成分數據庫[8]。將上面收集到的靶蛋白在數據庫UniProt[9](https://www.uniprot.org/)中進行校正，選擇物種為人，用靶蛋白的簡寫表示，建立藥物的靶點蛋白數據庫。

1.4 癲癇與藥對相關靶點的收集

在人類基因數據庫Genecards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、人類在線孟德爾遺傳平臺OMIM(https://omim.org/)中以“epilepsy”為關鍵詞，檢索出癲癇的相關靶基因，并與藥對中活性成分靶基因進行映射對比篩選出共同靶點，則為藥對活性成分治療癲癇的靶點。

1.5 疾病-活性成分-關鍵靶點基因網絡的構建

利用Cytoscape軟件構建疾病-活性成分-關鍵靶點基因的網絡圖[10]。網絡中各節點(node)分別代表疾病、活性成分和關鍵靶點基因；網絡中邊(edge)用來連接疾病與活性成分、活性成分與關鍵靶點基因；連接到網絡的節點以度值(degree)為單位進行表示[11]。某節點與其他節點連接的邊數越多，則說明該節點在網絡中扮演的角色越重要，度值也越大。通過Cytoscape所構建出來的藥物-活性成分-關鍵靶點基因聯系網絡圖來探索挖掘藥對在治療癲癇時的作用機制。

1.6 關鍵靶點PPI網絡的構建

通過在線檢索數據庫STRING[12](https://string-db.org/cgi/input.pl)，得到生物系統中相關蛋白質的結構和功能與基因之間的相互作用關系。將關鍵靶點導入STRING數據庫構建出靶點蛋白相關網絡，將結果以 TSV 格式導出，再通過Cytoscape獲取PPI網絡中度值為前10的關鍵基因(Hub Gene)。靶點蛋白相互作用的網絡示意圖由多個節點互相銜接而成，而Hub節點與其他節點銜接更為密切。Hub基因對于整個信息結果圖的構建必不可少。

1.7 得出GO生物學功能和KEGG通路富集分析

GO生物功能注釋是指利用生物信息學功能對基因進行生物功能分析。通過GO富集分析可以獲取基因的生物學功能。DAVID是一個專門對基因進行富集分析的工具。方法為將關鍵靶點基因導入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，利用在線分析得到靶點基因的GO生物功能注釋和KEGG通路富集。

2 結果

2.1 中藥復方的收集與篩選

初步檢索獲取文獻425篇，去重后嚴格按照納入標準和排除標準上去除294篇文獻，最后納入分析文獻131篇，方劑總數226個。226個方劑中共使用221種中藥，總的藥物使用頻次為2 510次。

2.2 運用關聯規則獲取藥對

運用SPSS Modeler中的Apriori進行建模，選取支持度>18，置信度>0.75，前項>6，進行關聯分析。所引文獻中藥物組合的關聯規則見圖1，表1。其中，置信度最高的且關聯性強的藥對是陳皮→半夏，在文獻中有64個實例，置信度為93.75%，支持度為23.75%。在此次分析規則中，置信度較高的藥對，可作為臨床上治療癲癇的常用藥對[13]。

2.3 陳皮-半夏所含化學成分的收集與篩選

在TCMSP數據庫中，得到陳皮化學成分63個，半夏化學成分116個。設置篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18后得到陳皮化學成分5個，半夏化學成分13個，得到目標化合物共18個。18個目標化合物的代碼及其相應的口服生物利用度和類藥性數值見表2。將收集到的18個目標化合物通過TCMSP庫進行檢索，得到 268個靶點蛋白，并通過Uniprot數據庫將收集到的靶點蛋白名轉換為基因名。將這268個靶點導入到 Cytoscape 3.6.0 軟件中進行網絡構建，得到陳皮-半夏主要活性成分-靶點網絡圖(見圖2)。圖2共有 160個節點、267條邊，紅色代表活性成分，灰色為靶點基因。

圖1 關聯關系可視圖Fig.1 Association relationship view

表1 治療癲癇處方中藥物的關聯規則(置信度≥0.75)Table 1 Association rules for drugs in the treatment of epilepsy prescription (confidence≥0.75)

表2 陳皮-半夏活性成分表Table 2 Chenpi-Banxia active ingredient list

2.4 疾病和藥物相關靶點的篩選

在Genecards、OMIM中以“epilepsy”為關鍵詞，檢索出癲癇的相關靶基因886個，并與陳皮-半夏活性成分的相關靶點基因進行匹配并繪制維恩圖。(見圖3)圖中得到共同靶點41個，說明陳皮和半夏配伍后可能存在協同作用，如參與GABRA1、GABRA5、NR3C2、ADIPOQ、GSK3B等靶點的生物過程。這些基因可能在陳皮-半夏治療癲癇的過程中發揮一定的作用，為了進一步闡釋陳皮-半夏治療癲癇的作用機制，將這41個靶點作為目標關鍵靶點進行分析。

2.5 構建與分析網絡

用STRING數據庫得到41個關鍵靶點之間的相互作用結果，將結果以TSV格式導出，并在此基礎上通過Cytoscape3.7.1獲取PPI 網絡中圖中顏色越深、圓圈越大則得分越高(見圖4)及其度值為前10的Hub基因(見圖5)。可以看出，這41個靶點間有相互作用，表明這些靶點相互聯系，并通過多途徑、多方面的協調來起到治療癲癇的作用，得分前10名的靶點基因依次為 AKT1、MAPK3、FOS、CREB1、CASP3、TP53、JUN、CAT、ESR1、VEGFA，表明這些基因在陳皮-半夏治療癲癇的過程中具有重要意義。同時，AKT1和其他基因的互相關聯程度最高，揭示其可能參與的藥理作用最為明顯。

圖2 陳皮-半夏主要活性成分-靶點網絡圖 Fig.2 Chenpi-Banxia main active ingredient-target network

2.6 GO生物學功能和KEGG通路富集

將41個關鍵靶點導入DAVID數據庫中，進行GO富集分析。圖6顯示GO富集分析中存在3個分支，即生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。在生物過程分析中，主要涉及對藥物的反應(response to drug，6個靶點)、脂肪細胞分化的正調節(positive regulation of fat cell differentiation，4個靶點)、Ras蛋白信號轉導(Ras protein signal transduction，3個靶點)、運動行為(locomotory behavior，4個靶點)以及ERK1和ERK2級聯的正調節(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade，4個靶點)、細胞對藥物的反應(cellular response to drug、3個靶點)等。在細胞組分分析中，主要涉及細胞質(cytosol)、細胞連接(cell junction)、突觸后膜(postsynaptic membrane)等。在分子功能分析中，主要涉及血清素結合(serotonin binding)、環磷腺苷效應元件結合(cAMP response element binding)、色氨酸結合(chromatin binding)等。表明陳皮-半夏可以通過參與調控多種生物學過程而發揮治療癲癇的作用。

圖3 疾病靶點基因與陳皮-半夏靶點基因匹配圖Fig.3 Matching of disease target genes and Chenpi-Banxia target genes

圖4 關鍵靶點PPI網絡圖Fig.4 PPI network diagram of key targets

圖5 關聯性強前十種蛋白Fig.5 Related to the top ten proteins

按照KEGG通路富集分析的P-value值排名，得出排名前十的通路(見圖7)。KEGG通路富集分析顯示，陳皮-半夏的關鍵靶點主要富集的通路為Serotonergic synapse(hsa04726血清素神經突觸信號通路)、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection(hsa05167卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路)、Hepatitis B(hsa05161乙型肝炎信號通路)、Estrogen signaling pathway(hsa04915雌激素信號通路)、Colorectal cancer(hsa05210結直腸癌信號通路)、TNF signaling pathway(hsa04668TNF信號通路)、Cholinergic synapse(hsa04725膽堿能突觸信號通路)、Amphetamine addiction(hsa05031苯丙胺成癮信號通路)、Relaxin signaling pathway(hsa04926松弛素信號通路)、Dopaminergic synapse(hsa04728多巴胺能突觸信號通路)。結果表明，陳皮-半夏的活性成分靶點分布于不同的通路，可通過對各通路協調作用來達到治療癲癇的目的。

圖6 GO富集分析結果Fig.6 GO enrichment analysis results

圖7 KEGG富集分析結果圖Fig.7 KEGG enrichment analysis results

為了更清晰的展現陳皮-半夏活性成分、核心靶點與通路之間的關系，使用Cytoscape軟件構建通路-活性成分-核心靶點網絡(圖8)。黃色示通路，綠色示活性成分，藍色示核心靶點。網絡圖可以直觀展示出陳皮-半夏具有通過多成分、 多靶點、多途徑相互協調作用于癲癇的特點。

圖8 通路-活性成分-核心靶點網絡圖 Fig.8 Active ingredient-active target-metabolic pathway network

3 討論

通過Apriori關聯規則分析目標數據庫里的用藥規律得到半夏與陳皮同時配伍治療癲癇置信度最高。方劑二陳湯[14]以半夏為君燥濕化痰，陳皮為臣理氣燥濕化痰，為治療痰證的通用方。中醫對癲癇根據以下六種證型分型治療，即近期有無發作分為發作期(兩型)和休止期(四型)。發作期主要根據發作時病人有無寒熱征象分為陽癇和陰癇。休止期有肝火痰熱證、脾虛痰盛證、肝腎陰虛證和瘀阻腦絡證。陽癇除典型表現外，可伴有明顯喉中痰鳴、眩暈、胸悶乏力、舌紅苔黃膩脈滑等痰熱證的癥狀。采用主方定癇湯以化痰、清熱、開竅、鎮驚為主[14]。陰癇則以典型表現外見口吐涎沫卻不啼叫，或聲音低微，伴有舌淡苔白膩脈沉緩等痰涎內阻證的癥狀。采用主方以五生飲合二陳湯。其中，定癇湯為治療癲癇的常用方。方中膽南星為君藥“治療一切風癇”，以半夏、陳皮佐以祛痰。不論陰癇陽癇，發作時均以祛痰為要義。對于休止期的肝火痰熱證和脾虛痰盛證也采用祛痰藥對半夏和陳皮。明·樓英《醫學綱目·癲癇》記載：“癲癇者，痰邪逆上也，……孔竅不通。故耳不聞聲，目不識人，而昏眩倒仆也”。朱丹溪《丹溪心法·癇》云：“無非痰涎壅塞，迷閉孔竅。”癲癇病因主要有情志失調、飲食不節等。其中情志方面可因猝然大恐大驚導致氣機失調、膽郁不升而引發痰濁內生。飲食方面多過食肥甘、脾胃受損而引起痰濁壅盛。

通過進一步挖掘陳皮與半夏中18個活性成分及其所調控的不同靶點， 推測其可能作用的關鍵靶點與通路，闡明其協同配伍作用治療癲癇的機制，體現陳皮-半夏配伍治療癲癇的多靶點、多通路的特點。關鍵基因在陳皮-半夏治療癲癇中具有重要意義，可能為陳皮-半夏藥對治療癲癇的重要靶點。其蛋白產物涉及了細胞凋亡、信號傳遞、神經調節、炎性過程調節等多個生理生化過程。AKT1(蘇氨酸激酶編碼蛋白)，在神經系統發育中作為一個關鍵的調控因子用于調節神經存活。有研究表明，癲癇持續狀態時，AKT1蛋白表達呈高峰，發作后期再次呈現高峰狀態[15]。VEGFA(血管內皮細胞生長因子)是一種與神經、血管生成均相關的神經營養因子。TP53是一種轉錄因子，在控制細胞生長和引發細胞調亡方面起著重要作用。CASP3(半胱天冬酶原-3)主要參與細胞凋亡，通過細胞內或外信號，激活CASP3從而發生細胞凋亡反應。JUN(JUN激酶)能夠促使MAPK(蛋白激酶)發生信號轉導反應，從而調節特定的基因表達來參與細胞凋亡。有研究表明FOS、JUN蛋白做為細胞內第三信使可特異性調節靶基因的表達從而改變癲癇腦神經元的表型表達，有利于癲癇興奮性易感性長期的形成和維持[16]。

KEGG通路富集分析得到的信號通路大多涉及神經通路與炎癥通路。Serotonergic synapse通路在學習記憶、情緒、睡眠、運動、內分泌等生理功能以及包括情緒異常、認知異常在內的病理狀態中發揮重要作用。Estrogen signaling pathway通路可調節諸多的生理過程，包括生殖、心血管保護、細胞穩態和行為等，通路中的重要遞質為5-HT，5-HT拮抗劑可通過減少過表達的c-Jun調控細胞的周期，阻止神經元凋亡，從而改善癲癇認知功能和自發性發作[17-21]。Hepatitis B通路參與多種功能，并調節轉錄、細胞信號級聯、增殖、分化和凋亡。TNF signaling pathway中的腫瘤壞死因子(TNF)作為一種關鍵細胞因子，可以誘導廣泛的細胞內信號通路，包括細胞凋亡和細胞存活以及炎癥和免疫。癲癇發作能夠導致炎性細胞因子TNF-α表達上調，可能誘發炎癥反應。研究發現，通過電刺激可顯著增加TNF-α水平，而大鼠全身應用TNF-α可促進癲癇樣放電，癲癇發作和TNF-α之間可能存在相互促進作用[21,22]。乙酰膽堿(ACh)是廣泛分布在中樞以及神經系統中的神經遞質。在神經系統中，ACh促進了許多功能，例如學習，記憶，注意力和電機控制，癲癇發作時，腦內的ACh釋放增加，ACh作用于大腦皮層從而引起神經細胞去極化，出現癲癇放電[23]。

中藥具有多成分、多靶點的特點。中藥的效應指的是中藥有效分子組合對機體生物分子網絡進行廣泛調節的綜合結果，而中藥中的某些活性化合物作用于體內，也是通過不同的通路對機體產生作用，從而起到治療效果。因此通過數據挖掘及網絡藥理學方法，可得到以中醫藥理論為基礎的“藥物-成分-靶點-通路”網絡，可全面認識中藥治療疾病的作用機制，為臨床治療提供數據支持。本研究采用數據挖掘和網絡藥理學方法，從文獻中剖析中醫治療癲癇的用藥規律，并根據剖析結果提出陳皮-半夏配伍對于癲癇可能存在的作用機制。單純從數據角度分析存在一定的不足，因此，對于陳皮-半夏治療癲癇的用藥規律及作用機制，還需進一步臨床驗證，從而更加系統、科學地闡述陳皮-半夏配伍治療癲癇的作用機制。